Desenvolvimento de luciferases emissoras de luz vermelha distante termoestáveis de Phrixotrix hirtus para finalidades bioanalíticas: relação estrutura e função

Resumo

Luciferases são enzimas responsáveis pela bioluminescência, a emissão de luz por organismos vivos. Elas catalisam oxidações altamente exergônicas de um substrato - a luciferina - onde a energia é liberada na forma de luz com alta eficiência. Luciferases de vagalumes são as mais bem conhecidas e apresentam um amplo espectro de emissão de luz, em geral do verde ao amarelo. Estas enzimas são amplamente utilizadas em diversas finalidades biotecnológicas, incluindo bioanálise de ATP, ensaios com genes repórter e bioimagem celular. Entretanto, a maioria das luciferases usadas como ferramentas bioanalíticas emite luz na faixa do verde-amarelo em pH fisiológico, sendo que para aplicações em amostras pigmentadas e tecidos de mamíferos, luciferases emissoras de luz vermelha são mais apropriadas. Além disto, as luciferases são em geral pouco estáveis a altas temperaturas, sendo necessário melhorar sua termoestabilidade para que as mesmas sejam aplicadas como reagentes e para bioimagem em tecidos de mamíferos. A luciferase de Phrixotrix hirtus é a única que naturalmente produz bioluminescência vermelha (623 nm). Porém esta enzima ainda sofre a desvantagem de ser instável a altas temperaturas. O objetivo principal deste projeto é produzir e selecionar mutantes termoestáveis da luciferase de P. hirtus, possivelmente com espectros de bioluminescência mais deslocados para o vermelho (>640 nm) em relação à luciferase selvagem, através de técnicas de mutagênese randômica e sítio-dirigida, e química combinatória com análogos de luciferina. Será investigada a relação entre estrutura e função destes mutantes obtidos através de modelagem molecular e determinação da estrutura tridimensional por cristalografia de raios X. Como objetivos secundários tentaremos a termoestabilização de outras luciferases disponíveis em nosso laboratório. (AU)