Sequenciamento completo de plasmídeos carreando genes de resistência a antibióticos em bactérias de interesse e análise do genoma de linhagens de Pseudomonas aeruginosa produtoras de SPM-1 e de KPC-2 por sequenciamento em larga escala

Resumo

Atualmente, o principal mecanismo de resistência a antibióticos em bactérias gram-negativas é a produção de enzimas que degradam antibióticos, destacando-se as beta-lactamases. A maioria dos genes codificadores de beta-lactamases está inserida em elementos genéticos móveis (MGE- do inglês Mobile Genetic Elements - integrons, transposons e elementos de inserção) inseridos, ou não, em plasmídeos. Atualmente, o sequenciamento completo do genoma e plasmídeo bacteriano permite o conhecimento de todo o seu conteúdo gênico, como elementos genéticos móveis, genes de resistência e genes de virulência carreados por linhagens epidêmicas. O sequenciamento de nova geração ou em larga escala estão disponíveis e permitem o sequenciamento completo e preciso destes genomas a um custo relativamente baixo. Objetivos: Sequenciar e anotar o draft do genoma de duas linhagens de P. aeruginosa, uma carreando o gene blaSPM-1 e outra o gene blaKPC-2; Identificar a possível presença de MGEs, ilhas de virulência e de patogenicidade em cada um desses genomas e potencialmente associadas ao gene blaSPM-1; Identificar provável presença de plasmídeos inseridos no cromossomo dessas linhagens de P. aeruginosa, e/ou analisar a presença de "cicatrizes" que indiquem como e quantas vezes elementos de transposição foram inseridos e/ou excisados no cromossomo bacteriano; Obter a sequência completa de plasmídeos ainda não tipáveis por técnicas convencionais ou de grande interesse epidemiológico que carreiam genes de resistência em bactérias gram-negativas de interesse clínico e/ou veterinário; Comparar os plasmídeos sequenciados por este projeto com os plasmideos depositados em bancos de dados públicos. Materiais e Métodos: Seleção dos genomas e plasmídeos: Será realizado sequenciamento e montagem e anotação do genoma draft de duas linhagens de P. aeruginosa previamente caracterizadas em nosso laboratório, P. aeruginosa HC84 carreando gene blaSPM-1 isolada no Hospital das Clinicas de Ribeirão Preto (HCFMRP-USP) em 2007 e P. aeruginosa BH6 carreando o gene blaKPC-2 isolada em hospital de Belo Horizonte em 2012. Estimamos selecionar para sequenciamento cerca de 4 a 6 plasmídeos não-tiáveis, extraídos de enterobactérias e/ou bacilos gram-negativos não-fermentadores. Também poderão ser selecionados aqueles plasmídeos que carreiam mais de um gene de resistência e aqueles presentes em bactérias epidemiologicamente importantes (clonalidade da bactéria avaliada por MLST e/ou pulsotipo). Preparo do DNA plasmideal e sequenciamento dos plasmídeos: DNA plasmideal será extraído utilizando o PureLinkTM HiPure Plasmid Filter Midiprep (Invitrogen) e experimentos de eletro-transformação e/ou conjugação serão realizados nos isolados selecionados, quando necessário, utilizando técnicas já descritas. O sequenciamento será realizado utilizando a plataforma Illumina MiSeq (Illumina, Inc), utilizando a estratégia de paired-end sequencing (2x300bp). Montagem e anotação dos genomas e plasmídeos: A qualidade do sequenciamento será verificada utilizando o programa FastQC (Babraham Bioinformatics) e a montagem 'de novo' será realizada utilizando o programa Velvet (European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI). A união dos contigs será confirmada por PCR seguido de sequenciamento pelo método de Sanger. Os dados serão então analisados utilizando a ferramenta Prokka e CLC Genomics Workbench (CLCbio, Quiagen), os softwares Artemis Version 8 (Sanger Institute) e Sequin. A confirmação e validação das ORFs serão realizadas utilizando BLASTN e BLASTP. Execução do projeto: A realização das análises de sequenciamento será realizada no Laboratório Especial de Bacteriologia e Epidemiologia Molecular - LEBEM pela pós-doutoranda selecionada. Para o suporte da análise do sequenciamento, teremos como colaboradores a Dra. Alessandra Carattoli e Dr. Alessandro de Mello Varani. (AU)