Construção e caracterização de promotores constitutivos mutantes e de promotores controlados pelos reguladores globais CRP e Fis em Escherichia coli

Resumo

No organismo bacteriano há os chamados reguladores globais, sendo eles os responsáveis pela regulação da expressão de diversos genes. Como parte desses reguladores temos os fatores de transcrição CRP, Fis e IHF, sendo eles de muita importância para a bactéria. Com isso, a sua ausência em bactérias mutantes pode alterar o metabolismo e crescimento das mesmas, influenciando em mudanças na expressão de genes não só por atuar como seu fator de transcrição, mas também por modificar a fisiologia geral da célula. Dessa forma, o presente plano de trabalho visa a análise do comportamento de alguns promotores descritos na literatura nas três linhagens de E. coli utilizadas como organismos modelos no laboratório (E. coli selvagem, mutante para Fis e mutante para IHF), e assim observar as diferenças na expressão gênica regulada por um mesmo promotor nas três linhagens, permitindo a normalização dos resultados obtidos em experimentos de promotores sintéticos. Outro objetivo de tal projeto é analisar as interações entre dois desses fatores de transcrição, criando uma biblioteca de promotores contendo os operadores para os reguladores CRP e Fis. A biblioteca será montada através da ligação aleatória de sequências consenso para os fatores de transcrição CRP e Fis, produzindo-se promotores sintéticos. Tais promotores sintéticos da biblioteca e os promotores retirados da literatura serão clonados no vetor pMR1, cuja sequência contém o gene repórter GFP e o gene de resistência para cloranfenicol. Os ensaios serão realizados no leitor de placas, citometria de fluxo e microscopia de fluorescência.