Busca de alvos dos microRNAs miR-450a e miR-450b, pelo método PAR-CLIP, nas linhagens de carcinoma de ovário A2780 e SKOV-3

Resumo

O câncer de ovário é câncer ginecológico mais letal existente, sendo que a maioria dos pacientes têm uma taxa de sobrevivência menor que cinco anos após o diagnóstico, devido à falta de sintomas em seus estágios iniciais. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver biomarcadores para ajudar a diagnosticar o câncer de ovário em seu início. MicroRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA não codificadoras que atuam regulando processos biológicos críticos, tais como o desenvolvimento, proliferação celular, diferenciação, metabolismo e apoptose. Muitos miRNAs estão associados com a tumorigênese, e alguns deles funcionam como oncogenes ou genes supressores tumorais. MiRNAs desempenham um papel importante na regulação pós-transcricional e inibem a expressão de genes guiando o chamado complexo de silenciamento induzido por RNAs em direção a sequencias com sítios parcialmente complementares encontrados principalmente nas regiões não traduzidas de mRNAs alvo. Dados de estudos conduzidos como parte do meu doutoramento revelaram que os miRNAs miR-450a e miR-450b-5p são pouco explorados e predominantemente subexpressos em linhas celulares tumorais de ovário em comparação com tecidos normais correspondentes. O estudo também mostrou que ambos os miRNAs prejudicaram a migração e invasão em modelos de cultura de células bem estabelecidos de linhagens celulares de tumor de ovário (A2780 e SKOV-3). Além disso, a superexpressão de miR-450a resultou em uma taxa mais elevada de anoikis nas células A2780 e SKOV-3. Adicionalmente, com o objetivo de identificar alvos dos miRNAs miR-450a e miR-450b, nós realizamos o RNA-Seq para gerar o perfil do transcriptoma de células A2780 com superexpressão miR-450a (A2780+pLVX-miR-450a) ou miR-450b (A2780+pLVX miR-450b) comparadas com a linhagem controle A2780 +pLVX). Entre as vias mais enriquecidas encontrava-se a via de "Interações de superfícies celulares da família das Integrinas". Esse dado é consistente com o fenótipo de migração e invasão observado. Enquanto a análise de RNA-Seq revelou múltiplos genes com expressão modificada, as alterações de expressão podem ser diretas ou indiretas. O objetivo deste projeto é encontrar alvos dos miRNAs miR-450a e miR-450b para entender melhor sua função no sistema do câncer de ovário. Pretendemos realizar a técnica Argonaute (AGO) PAR-CLIP (Photoactivatable Ribonucleoside Enhanced Crosslinking e Immunoprecipitation) para identificar de forma abrangente os alvos dos miRNAs nas linhagens SKOV3 e A2780. O PAR-CLIP é um método baseado em sequenciamento de próxima geração (NSG) que permite a identificação de alvos de miRNAs e sítios de ligação de proteínas de ligação a RNAs (RBP) em uma escala transcriptômica e resolução de nucleotídeos. O AGO PAR-CLIP revelará transcritos sob o controle direto do miRNAs miR-450a ou miR-450b, bem como a competição e sinergia dentro da rede reguladora controlada por miRNAs. O método PAR-CLIP e a análise posterior serão realizadas em colaboração com o Dr. Markus Hafner, que os desenvolveu. Esse conhecimento nos permitirá identificar novos alvos terapêuticos valiosos para o tratamento, diagnóstico e prognóstico do câncer de ovário.