Expressão heteróloga, purificação e caracterização de enzimas envolvidas na via biossintética da neurotoxina cianobacteriana anatoxina-a(s)

Resumo

Sphaerospermopsis torques-reginae é uma espécie cianobacteriana plactônica com ampla distribuição em vários ambientes aquáticos brasileiros. Algumas linhagens dessa espécie são conhecidas por produzir o organofosforado neurotóxico anatoxina-a(s) (ANS), o qual é um potente e irreversível inibidor da enzima acetilcolinesterase, que atua no sistema nervoso periférico de mamíferos. A estrutura da ANS já foi elucidada, entretanto, a sua via biossintética ainda permanece desconhecida. O sequenciamento e a montagem do genoma da S. torques-reginae ITEP-024 (linhagem brasileira produtora de ANS) pelo nosso grupo de pesquisa possibilitou detectar um agrupamento gênico potencialmente envolvido na produção da ANS. Dessa maneira, este projeto de doutorado tem como objetivo superexpressar as enzimas chaves da biossíntese da ANS, purificá-las, caracterizá-las e testar suas atividades com a finalidade de comprovar a rota biossintética proposta. Para isso, será realizada a síntese dos genes codificadores dessas enzimas, os quais serão inseridos em vetor de expressão para Escherichia coli. A purificação dessas enzimas será realizada por cromatografia de afinidade e de exclusão molecular e suas atividades serão testadas, visando comprovar a formação dos intermediários esperados da síntese de ANS. As enzimas alvos ainda terão suas estruturas tridimensionais determinadas por difração de Raio-X. A produção dos intermediários da síntese será verificada por análises químicas usando espectrometria de massas. Este estudo contribuirá para a elucidação da via biossintética da ANS, podendo gerar patente e também possibilitará o desenvolvimento de métodos rápidos e sensíveis para a detecção e monitoramento desta toxina em águas usadas para abastecimento público, além de oferecer potencial para o desenvolvimento de novos fármacos. (AU)