Investigação do papel da metilação de RNA m6A na biogênese e processo de arm-switching de microRNAs utilizando zebrafish como modelo biológico.

Resumo

O processo de arm-switching dos microRNAs (miRNAs) possui grande impacto na regulação gênica. Este processo ocorre devido a seleção diferencial dos braços 5p e 3p dos miRNAs que serão incorporados ao complexo miRISC durante o desenvolvimento ontogenético dos organismos, nos tecidos diferenciados ou mesmo entre diferentes espécies. Este fenômeno tem reconhecido impacto biológico, uma vez que os miRNAs 5p e 3p comumente atuam sobre processos biológicos distintos, e sua desregulação está associada a diversos tipos de câncer. Desta maneira, a correta expressão dos braços 5p e 3p dos miRNAs é fundamental para direcionar a adequada diferenciação celular nos variados tecidos. Até o momento, entretanto, não foram elucidados os mecanismos moleculares responsáveis pelo controle do arm-switching. Recentemente a metilação m6A foi descrita como um passo importante durante a biogênese dos miRNAs, servindo como sítio de reconhecimento da enzima DROSHA, responsável por clivar o pri-miRNA durante sua biogênese e determinar as porções finais dos miRNAs maduros. Considerando-se que esta metilação é capaz de alterar a estrutura secundária de RNAs mensageiros (mRNAs) e que a região do corte promovido pela DROSHA é influenciada pela estrutura secundária do pri-miRNA, a hipótese desta proposta é que a metilação m6A também poderia alterar a estrutura secundária do pri-miRNA, promovendo clivagens alternativas pela DROSHA. Sabendo-se que a seleção do braço canônico ocorre devido à maior instabilidade de sua porção 5', estas clivagens alternativas podem ser responsáveis pelo evento de arm-switching. Com o objetivo de testar esta hipótese, propõe-se a análise dos padrões de arm-switching e de metilação m6A de pri-miRNAs na espécie modelo Danio rerio (zebrafish). Adicionalmente, será avaliada a potencial influência da metilação m6A na seleção do braço canônico, a partir do knockout dos sítios de metilação e quantificação da expressão dos braços 5p e 3p. Estes experimentos ampliarão o conhecimento sobre o processo de biogênese e atividade regulatória de miRNAs durante o desenvolvimento de vertebrados.