Inibidores de serinoproteases em células pulmonares e em enfisema pulmonar

Resumo

A DPOC (doença pulmonar obstrutiva crônica) é uma das maiores causas de morbidade e mortalidade no mundo, ainda não há tratamento que reverta os danos fisiopatológicos observados em pacientes acometidos por esta doença. Uma das causas atribuídas para o aparecimento da doença é o tabagismo, no entanto, causas genéticas e a contaminação ambiental também estão envolvidas com o aparecimento da doença em humanos. O enfisema pulmonar (caracterizado pela destruição do tecido alveolar) apresenta-se como uma das manifestações da DPOC. Algumas enzimas estão envolvidas com o processo de instalação do enfisema como as metaloproteases 9 e 12 e as serinoproteases, especificamente a elastase de neutrófilos humana. Em projeto anterior financiado pela FAPESP (2011/07001-1), os inibidores de serinoproteases rBmTI-A e rBmTI-6 foram testados em modelo de enfisema pulmonar em camundongos, mostrando efeito protetor contra a doença e atividade anti-inflamatória. Os inibidores rBmTI-A e rBmTI-6 são originários do carrapato Rhipicephalus Boophilus microplus, pertencentes à família Kunitiz- BPTI. rBmTI-A apresenta dois domínios do tipo Kunitz-BPTI e atividade inibitória sobre elastase de neutrófilos humana (HNE), tripsina bovina, plasmina e Calicreína Plasmática Humana. rBmTI-6 apresenta três domínios do tipo Kunitz-BPTI e inibe tripsina bovina e plasmina.Como no projeto anterior utilizamos o rBmTI-A íntegro (dois domínios), no presente projeto objetivamos clonar, produzir e investigar o efeito dos domínios inibitórios do rBmTI-A (domínios 1 e 2), separadamente, no modelo de enfisema pulmonar em camundongos. Avaliaremos o potencial de cada um dos domínios na resposta contra a doença. Esta avaliação será feita por meio da medida do intercepto linear médio (Lm) dos alvéolos pulmonares, quantificação de leucócitos presentes nos lavados broncoalveolares (BALs), avaliação da presença de atividades proteolíticas e de citocinas nos BALs, e, quantificação de fibras elásticas e colágenas nos pulmões dos animais utilizados. Investigaremos também o efeito (anti-inflamatório) de rBmTI-A e rBmTI-6 sobre células epiteliais pulmonares humanas A549 que serão induzidas à resposta inflamatória utilizando a elastase pancreática porcina e células BEAS-2B que serão induzidas à inflamação com o LPS. Nos dois modelos experimentais celulares serão quantificadas as citocinas inflamatórias presentes no meio de cultura das células e também por PCR em tempo real estas citocinas terão o nível de transcrição medido. Também avaliaremos a hipótese do envolvimento de receptores do tipo PAR (protease activated receptor), PAR-1 e PAR-2 na resposta ao efeito dos inibidores nas células epiteliais pulmonares (A549 e BEAS-2B), utilizando antagonistas destes inibidores e a incubação com rBmTI-A ou rBmTI-6 e posterior avaliação da produção de citocinas por estas células. (AU)