Análise da interação Orc1/Cdc6-DNA durante o ciclo de vida de Trypanosoma cruzi

Resumo

O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas. Apesar de ser a maior causa de doença cardíaca induzida por infecção em todo o mundo, não há vacina, e as únicas drogas têm efeitos colaterais graves. Esforços para gerar novas terapias são dificultados por limitações na compreensão da biologia do parasita. Durante o ciclo de vida, o T. cruzi alterna-se entre formas proliferativas (amastigota e epimastigota), e não proliferativas (tripomastigota e tripomastigota metacíclico). Além disso, foi demonstrado recentemente o desenvolvimento de formas amastigotas dormentes que não proliferam e são resistentes ao tratamento. Nosso laboratório estuda a replicação do DNA em tripanosomas, e demonstrou que a proteína Orc1/Cdc6 é um componente do complexo de pré-replicação (CPR). Em eucariontes, este complexo associa-se a origens de replicação, nucleando assim o processo de duplicação genômica em pontos específicos do DNA. Em tripanossomas, nosso grupo mostrou que Orc1/Cdc6 permanece associada ao DNA durante todo o ciclo celular da forma replicativa epimastigota e também interage com DNA na forma amastigota. No entanto, nas formas tripomastigotas e tripomastigotas metacíclicas, incapazes de duplicar o material genético, Orc1/Cdc6 localiza-se no espaço nuclear, mas é incapaz de interagir, ou interage fracamente, com o DNA, fato que deve contribuir para a ausência de replicação nestas formas. Este projeto visa primeiramente avaliar a interação de Orc1/Cdc6 com o DNA nas formas amastigotas dormentes a fim de gerar um panorama da interação Orc1/Cdc6-DNA durante todo o ciclo de vida de T. cruzi. Pretendemos então buscar possíveis mecanismos responsáveis por inibir a interação Orc1/Cdc6-DNA nas formas não replicativas. Nossa primeira abordagem será buscar modificações pós traducionais (MPT) presentes em Orc1/Cdc6 exclusivamente nas formas replicativas ou não replicativas de T. cruzi e verificar o possível papel destas MPTs na interação diferencial de Orc1/Cdc6-DNA. Alem disso, pretendemos buscar interatores de Orc1/Cdc6 durante o ciclo de vida deste parasita a fim de identificar possíveis moduladores da interação Orc1/Cdc6-DNA. Para tanto, pretendemos purificar Orc1/Cdc6 das diferentes formas de T. cruzi e avaliar (i) as MPTs e (ii) os interatores de Orc1/Cdc6 por espectrometria de massas. Os dados obtidos serão validados através de gerações de linhagens específicas e posterior análise da interação Orc1/Cdc6-DNA.