Caracterização da N-acetiltransferase NAT10 de Leishmania

Resumo

Leishmania sp. é o agente etiológico das leishmanioses, um grupo de doenças que pode se manifestar de três formas principais: cutânea, mucocutânea e visceral. A diversidade dos casos clínicos apresentados variam de acordo com as espécies de Leishmania, sendo descritas mais de 20 espécies que podem afetar o homem. Durante seu ciclo de vida Leishmania sp circula entre um hospedeiro invertebrado e um hospedeiro vertebrado, e para sobreviver as diferenças ambientais encontradas precisa se adaptar através de alterações na regulação da expressão gênica, tradução e metabolismo. A regulação da expressão gênica em Leishmania ocorre principalmente pós-transcricionalmente, através de mecanismos de estabilização dos mRNAs e da regulação da tradução. Diferentes modificações pós-transcricionais já foram descritas para mRNAs, como por exemplo, metilação e pseudouridilação, conjuntamente chamadas de epitranscriptoma. Recentemente foi descrito que mRNAs podem ser modificados por acetilação em células de mamíferos, modificação antes descrita somente para tRNA e rRNAs, pela atividade da N-acetiltransferase NAT10. A acetilação de mRNAs ocorre em citidinas e é denominada N4-acetilcitidina (ac4C), tendo grande impacto em promover aumento na estabilidade dos mRNAs de maneira geral e promover incremento na eficiência da tradução. Considerando que regulação pós-transcricional é crucial para Leshmania sp., neste projeto iremos estudar o papel da acetilação de mRNA neste parasita. Através de análises de bioinformática identificamos o gene homólogo de NAT10 em Leishmania mexicana, e com o uso da técnica de CRISPR-Cas9 geramos linhagens hemi-nocautes, onde substituímos uma das cópias do gene, e superexpressoras da proteína NAT10 contendo uma proteína fluorescente fusionada. Não foi possível obter parasitas nocautes, sugerindo que este gene é essencial para Leishmania. Além disso, determinamos que a proteína possui localização nuclear, e que as linhagens hemi-nocautes apresentam uma taxa de replicação das formas promastigotas menor que a linhagem selvagem. Todos estes dados preliminares demonstram que NAT10 pode desempenhar papel essencial nos mecanismos pós-transcricionais de regulação da expressão gênica em Leishmania. Assim, para melhor entender o papel desta proteína, pretendemos neste projeto: i) avaliar o papel da NAT10 na acetilação de mRNAs em L. mexicana; ii) avaliar o papel da NAT10 nos processos de crescimento e diferenciação de L. mexicana; iii) investigar o papel da NAT10 na transcrição global em L. mexicana; iv) investigar o papel da NAT10 no processo de tradução em L. mexicana; v) avaliar a capacidade anti-leishmanicida de inibidores de NAT10. Esperamos com este projeto contribuir para melhor entendimento de um mecanismo essencial para Leishmania, que abre perspectiva de explorá-lo como potencial alvo para desenvolvimento de novos fármacos para tratamento desta doença de importância mundial. (AU)