Proteômica quantitativa por LC-MS baseada em alvos (SRM) para determinação de ligantes e interface de interação do complexo com cistatina B, marcador de prognóstico de câncer de boca

Resumo

Cistatina B (CSTB) é uma importante proteína reguladora da carcinogênese, angiogênese e crescimento tumoral. Em nosso trabalho anterior (Carnielli et al., 2018), mostramos que menores níveis de CSTB na região do fronte tumoral estão associados a um pior prognóstico de pacientes com carcinoma de células escamosas ou epidermóide (CEC), além de correlacionar os níveis de CSTB à recorrência local de pacientes com CEC. Embora trabalhos tenham demonstrado CSTB com valores de diagnóstico e de prognóstico, o papel dessa proteína em câncer ainda não é bem compreendido. Assim, os objetivos desse estudo são i) identificar parceiros de interação da CSTB para entender a via de sinalização dessa proteína; ii) selecionar parceiros da CSTB para realizar as análises da interface de interação proteína-proteína; e iii) determinar a estequiometria desse complexo de interação. Para isso, será utilizado estratégia de proteômica quantitativa baseada em descoberta (DDA, aquisição dependente dos dados) e em alvos por SRM (Selected Reaction Monitoring). Os parceiros de interação da CSTB serão avaliados em pelo menos quatro linhagens celulares. Para isso, duas abordagens serão utilizadas: i) imunoprecipitação da proteína endógena na presença de um crosslinker (realizado in vivo) e ii) interação das proteínas recombinantes selecionadas e CSTB purificada de E.coli na presença de crosslinker para estabilizar as ligações do complexo, seguidos por análise proteômica baseada em espectrometria de massas (XL-MS), utilizando DDA e SRM; respectivamente. A combinação das diferentes técnicas permitirá além da identificação dos parceiros de interação da CSTB, o estudo das interfaces de interação dos mesmos, bem como a estequiometria das proteínas do complexo, por metodologia quantitativa de SRM. Esse trabalho é pioneiro na área de CEC oral, uma vez que além da CSTB ter sido revelada como marcador independente de prognóstico e ser uma potencial candidata à alvo terapêutico dessa doença, estudaremos estratégias para modular a sinalização da proteína por meio da análise da interação de CSTB e seus parceiros. (AU)