Infecção polibacteriana das membranas corioamnióticas: regulação temporal da interação microbiana e resposta inflamatória/oxidativa

Resumo

Embora a etiologia do parto pré-termo seja multifatorial, vários microrganismos têm sido associados à sua patogênese, uma vez que as espécies bacterianas mais frequentemente isoladas no líquido amniótico de pacientes com infecção intra-amniótica são comumente encontradas na microbiota vaginal. Apesar da infecção da cavidade amniótica ser a principal causa do parto pré-termo espontâneo, existe uma complexidade nesse cenário infeccioso por possuir comunidades bacterianas diferentes envolvidas, diferentes interações entre espécies, respostas diferentes aos antibióticos e resultados clínicos distintos. Objetivo: Avaliar a regulação temporal da resposta inflamatória/oxidativa em modelos in vitro de infecção polibacteriana das membranas corioamnióticas com diferentes associações de espécies bacterianas associadas ao parto pré-termo, na presença ou não diferentes espécies de Lactobacillus. Metodologia: Em cada subprojeto um total de 10 membranas corioamnióticas, obtidas de gestações de termo, serão desafiadas in vitro com diferentes combinações das principais espécies bacterianas identificadas no trato genital inferior de gestações complicadas por parto pré-termo, na concentração de 103 ou 106 Unidades Formadoras de Colônias. Amostras de membranas corioamnióticas sem estímulo bacteriano serão usadas como controle negativo e como controle positivo será utilizado o lipopolissacarídeo de Escherichia coli. Para a avaliação da regulação da expressão e produção dos diferentes marcadores inflamatórios/oxidativos aqui propostos, para cada tratamento serão coletados e armazenados a -80ºC os sobrenadantes e tecidos remanescentes nos seguintes momentos: 6 horas,12 horas, 18 horas e 24 horas. Os sobrenadantes obtidos das culturas de membranas corioamnióticas serão submetidos à quantificação proteica pela tecnologia Luminex do painel composto por IL-1², IL-6, sIL-6R, sgp130, IL-8, IL-10, IL-13, GM-CSF, TNF-±, hBD1, hBD2, hBD3, PTX3 e PGE2. Os tecidos remanescentes serão utilizados para a análise da expressão gênica e proteica de mIL-6R, gp130, TLR-2, TLR-4, TLR-6, NOD1 e NOD2 por PCR em tempo real e Western Blotting, respectivamente. Adicionalmente, será realizada a imunolocalização com construção de imagem 3-dimensional de IL-6 e seus receptores de membrana (mIL-6R e gp130) nas membranas fetais por imunofluorescência. Para avaliar o estresse oxidativo, após extração proteica, serão quantificados os níveis de 3-nitrotirosina, de carbonilação proteica e da capacidade antioxidante total. A caracterização ultraestrutural dos fragmentos das membranas fetais após estímulo com diferentes combinações de espécies bacterianas será realizada por microscopia eletrônica. Além disso, as interações bacterianas nas membranas fetais serão analisadas em microscópio confocal. (AU)