Análise do efeito dose-resposta da epigalocatequina-3-galato (EGCG) na adesão bacteriana, no crescimento inicial de biofilme de Streptococcus mutans e na progressão da lesão cariosa induzida em esmalte bovino

Resumo

O objetivo desse estudo será avaliar o efeito dose-resposta de epigalocatequina-3-galato(EGCg) na adesão bacteriana, crescimento inicial de biofilme de Streptococcus mutans e na progressão da lesão cariosa induzida em esmalte bovino. Inicialmente, será determinada a concentração inibitória mínima da EGCg sobre S. mutans. A partir dessa análise serão escolhidas concentrações 10x (EGCg C1),100x (EGCg C2) e 1000x (EGCg C3) maiores do que a MIC para o estudo em biofilme. Assim, serãoadotados três regimes experimentais. I) Blocos de esmalte de microdureza de superfície (DS) conhecida(n=12/grupo) serão imersos em saliva humana para a formação da película adquirida. Em seguida, os blocos serão expostos a tratamentos de 1 minuto com NaCl 50 mM (controle negativo), EGCg C1, EGCGg C2, EGCg C3 ou clorexidina 0,12% (controle positivo). Após os tratamentos, os blocos serão transferidos para placas de 24 poços contendo um inóculo de S. mutans UA159 formado em meio de cultura ultrafiltrado a base de triptona e extrato de levedura (UTYEB) suplementado com glicose 1%, onde serãomantidos por 8 h para que ocorra adesão do biofilme a película adquirida. Ao final desse período, o pH do meio de cultura será aferido, o biofilme será coletado para análise de contagem de unidades formadoras de colônia (UFC) e os blocos de esmalte serão analisados quanto ao percentual de perda de microdurezade superfície (%PDS). II): Blocos de esmalte bovino (4x7x1 mm) com (DS) conhecida (n=12/grupo) imersos em saliva humana para a formação da película adquirida. Em seguida, os blocos serão transferidos para placas de 24 poços contendo um inóculo de S. mutans UA159 formado em meio de cultura UTYEB suplementado com glicose 1%, onde serão mantidos por 8 horas. Ao final desse período, o pH do meiode cultura será aferido, os blocos contendo o biofilme aderido serão lavados em NaCl 50 mM e, em seguida, serão expostos por 1 minuto a NaCl 50 mM (controle negativo), EGCg C1, EGCGg C2, EGCg C3 ou clorexidina 0,12%(controle positivo). Em seguida, os blocos serão transferidos para um meio de cultura fresco (LMW + glicose 1 mM), onde permanecerão por 16 horas. Após esse período, o pH do meioserá aferido, o biofilme será coletado para contagem de UFC e os blocos de esmalte serão avaliados quanto ao percentual de perda de microdureza de superfície. III) Blocos de esmalte bovino (4x7x1 mm) com DSconhecida (n=12/grupo) serão submetidos a formação de lesão cariosa induzida por modelomicrobiológico. Dessa forma, biofilmes formados nos blocos de esmalte cobertos com película adquirida serão cultivados por 5 dias com exposição a sacarose 1%. A renovação do meio será realizada duas vezes ao dia, sendo os tratamentos com NaCl 50 mM, EGCg C1, EGCGg C2, EGCg C3, ou clorexidina 0,12% (controle positivo) realizados antes de cada troca de meio de cultura. Ao final dos 5 dias, os blocos de esmalte serão coletados para avaliação das alterações estruturais (perda integrada de microdureza), morfológicas (microscopia eletrônica de varredura), e químicas (dosagem de cálcio e fósforo por Espectroscopia Eletrônica de Análise Química) do esmalte o biofilme será coletado para análises decontagem de unidades formadoras de colônias, peso seco e polissacarídeos intra e extracelulares Os dados do efeito dose-resposta de EGCg sobre UFC, pH e %PDS (regimes experimentais I e II), perda integrada de microdureza e valores de cálcio e fósforo medidos com EDS, UFC, pH e polissacarídeos (regime experimental III) serão avaliados por regressão linear. (AU)