L-asparaginase quimérica e peguilada: estudo das condições de expressão, produção e purificação de biofármaco antileucêmico inovador com potencial de baixa imunogenicidade

Resumo

A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é o câncer mais comum em crianças em todo o mundo e é caracterizada pela superprodução de linfoblastos indiferenciados na medula óssea. O tratamento de primeira escolha é com a enzima L-asparaginase (ASNase) isolada de Escherichia coli ou Erwinia chrysanthemi. Seu mecanismo de ação é por meio da hidrólise da L-asparagina plasmática em ácido aspártico e amônia. As células leucêmicas, diferentemente das células saudáveis, são incapazes de sintetizar L-asparagina em quantidade suficiente para sua sobrevivência por causa da reduzida expressão do gene da asparagina sintetase. Essas células necessitam da L-asparagina plasmática para sobreviver e, portanto, a ASNase causa morte das células cancerígenas por inanição. As formulações de ASNase de E. coli e E. chrysanthemi podem causar efeitos colaterais adversos significativos, especialmente imunogenicidade. A PEGilação de E. coli ASNase é uma estratégia de modificação pós-traducional para minimizar a imunogenicidade e envolve a ligação covalente de polietilenoglicol (PEG) a epítopos de camuflagem na enzima. No entanto, as restrições conformacionais impostas pela ligação covalente do PEG diminuem a atividade enzimática e o sistema imunológico também podem gerar anticorpos contra o PEG. Este projeto tem os seguintes objetivos: 1) otimizar as condições de cultura para produzir uma E. coli ASNase quimérica em um biorreator 3L; 2) purificar e PEGuilar N-terminal esta ASNase; 3) caracterizar a estrutura e função da enzima; 4) avaliar a citotoxicidade in vitro da enzima contra diferentes linhas celulares leucêmicas; e 5) avaliar in vivo a depleção de asparagina e glutamina e a imunogenicidade da enzima quimérica PEGuilada em modelos de camundongos de ALL. Espera-se que essas variantes sejam ativas, fisicoquimicamente estáveis e menos imunogênicas do que a E. coli ASNase existente, fornecendo uma plataforma para o futuro desenvolvimento biofarmacêutico. (AU)