Um kit de ferramentas especiômicas para investigar alterações mediadas por ácidos graxos na especiação plasmática de zinco e seus efeitos fisiológicos

Resumo

O trabalho da equipe mostrou que existe uma relação alostérica entre o transporte de ácidos graxos não esterificados circulantes (NEFA) e o manuseio de zinco no plasma através da ligação à albumina sérica humana (HSA). Isso sugere que a especiação plasmática de zinco é influenciada pelos AGNE nos estados de doença de uma maneira que afeta os processos circulatórios, incluindo coagulação e sinalização de insulina. Examinaremos como a ligação de misturas fisiologicamente relevantes de NEFAs altera a ligação de zinco à HSA usando ITC. Avaliaremos como os NEFAs influenciam a especiação plasmática de zinco usando uma abordagem estabelecida incorporando 2D-PAGE combinado com LA-ICP-MS, que será desenvolvido para incluir técnicas adicionais de separação e análise. Também desenvolveremos uma abordagem sob medida incorporando separação bidimensional com MS quantitativa e ICP-MS para avaliar as mudanças de especiação induzidas por NEFA. As propriedades de ligação ao zinco das proteínas mais interessantes identificadas serão analisadas usando análises ITC, ESI-MS e IMMS. O efeito das alterações induzidas por NEFA nas propriedades de ligação ao zinco da HSA na farmacodinâmica da insulina será avaliado usando uma abordagem baseada em FRET. O fluxo de zinco em HUVECs primários será medido usando um método estável baseado em isótopos de Zn para determinar como os NEFAs influenciam a homeostase celular de zinco, com especiação intracelular examinada usando o 2D-PAGE / LA-ICP-MS. A combinação dessas abordagens nos permitirá identificar proteínas que se ligam ao zinco à medida que o fluxo líquido para dentro da célula aumenta em resposta aos NEFAs. Finalmente, examinaremos como os NEFAs influenciam a sinalização de insulina nos HUVECs. A ativação de vias específicas a jusante será avaliada usando anticorpos específicos, ensaios de qPCR e luciferase. (AU)