Análise histopatológica de glândula submandibular de camundongos K18-hACE2 infectados por SARS-CoV-2

Resumo

Em dezembro de 2019, foi identificado o primeiro caso do novo coronavírus SARS-CoV-2 em Wuhan, que se espalhou pelo mundo causando uma doença potencialmente fatal denominada COVID-19. Estudos demonstraram que a saliva é um importante meio de transmissão do SARS-CoV-2, pois as glândulas salivares são rotas para infecção, replicação e transmissão viral devido a considerável presença da enzima conversora de angiotensia-2 (ACE2), bem como a expressão da enzima serina protease transmembrana II (TMPRSS2) em células da glândula submandibular de pacientes infectados. A criação recente dos novos camundongos transgênicos k18-hACE2 são bons modelos para estudo da COVID-19, pois apresentam a ACE2 humana (hACE2). Desta forma, a proteína Spike (S) do vírus liga-se ao receptor hACE2 das células desses animais, infectando-as e causando a doença. Durante a COVID-19, as citocinas IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, e TNF-± apresentam papel fundamental na resposta inflamatória sistêmica causada pela COVID-19. O aumento dessas citocinas culmina numa hipercitocinemia denominada "tempestade de citocinas" que exacerba a inflamação e ativa metaloproteinases da matriz (MMPs), tal como a MMP-1, cuja função é degradação dos colágenos I e III, os quais compõem o estroma das glândulas salivares. Neste estudo, será proposto avaliar a imunolocalização da proteína spike do SARS-CoV-2, bem como da enzima hACE2 nas glândulas submandibulares de camundongos k18-hACE2 infectados com SARS-CoV-2. Será também verificada a participação das citocinas inflamatórias IL-6 e TNF-±, e da MMP-1 nas glândulas desses animais, bem como o impacto da infecção na integridade estrutural do tecido glandular e na imunoexpressão do fator de crescimento epidermal (EGF). Serão utilizados 10 camundongos k18-hACE2 adultos distribuídos em dois grupos: 5 dias (G5D) e controle (GC). Os animais do G5D serão inoculados com 5x104 PFU (em 40 µL) por via intranasal. Os animais do GC serão inoculados com igual volume de meio de cultura DMEM. Após 5 dias de infecção, as glândulas serão fixadas e processadas para inclusão em historesina e parafina. Nos cortes de historesina corados com H.E., será realizada a análise de densidade de volume de ácinos, ductos, tecido conjuntivo e vasos sanguíneos. Os cortes de parafina serão submetidos às reações de imunofluorescência para a imunolocalização da proteína spike viral e da enzima hACE2. Será também avaliada a imunoexpressão de IL-6, TNF-± e EGF, por imunofluorescência, e de MMP-1 por imuno-histoquímica. A intensidade da imunoexpressão de cada uma dessas citocinas/proteínas será avaliada quantitativamente e os resultados serão submetidos a análise estatística utilizando-se o Student t-test (pd0,05).