Equipando anticorpos e bactérias para uso diagnóstico e terapêutico de tumores.

Resumo

No presente projeto de pesquisa pretendemos usar dois biomarcadores específicos, que se localizam na superfície externa da membrana de células do microambiente tumoral, o antígeno específico prostático de membrana (PSMA) e o antígeno carcinoembrionário (CEA), como alvos para o direcionamento de sondas fluorescentes, drogas antitumorais ou bactérias terapêuticas. Para isso, dois nanocorpos já descritos e caracterizados serão usados como base para esse direcionamento aos biomarcadores de superfície: o nanocorpo anti-PSMA chamado NB7 e o nanocorpo anti-CEA chamado NbCEA5. Com isso duas metodologias antitumorais serão testadas e comparadas:1 - Nanocorpos carregando drogas antitumorais. Um resíduo de p-azido-fenilalanina (p-azido-Phe ou pAzF) será bioincorporado em uma posição específica destes nanocorpos, durante a expressão em células de E. coli. A presença deste grupamento azida permitirá a posterior conjugação desses nanocorpos com sondas fluorescentes (Cy5) ou a drogas antitumorais (monometil Auristatina E MMAE) por click-chemistry. Espaçadores cliváveis e não cliváveis serão usados para comparação quanto a citotoxicidade em células tumorais.2 - Nanocorpos direcionando bactérias terapêuticas. Bactérias terapêuticas (antitumorais) serão preparadas e transformadas para expressar e expor esses nanocorpos em suas superfícies, de tal forma que as bactérias terapêuticas sejam guiadas as células tumorais PSMA ou CEA positivas. Essa exposição dos nanocorpos será feita através da fusão com uma proteína da membrana externa da E. coli chamada intimina. Além disso, para a programação das bactérias antitumorais usaremos vetores plasmidiais com um circuito de genes ativados por uma concentração mínima de um sinalizador quórum sensing (N-acil-homoserina lactona, AHL) que só é atingida quando se tem uma população mínima de bactérias crescendo num mesmo ambiente. E este circuito de genes quando ativado faz a bactéria produzir uma proteína antitumoral (terapêutica), e uma proteína que provoca a lise da célula bacteriana, de tal forma que, a proteína terapêutica seja liberada para a vizinhança pela lise sincronizada de uma população mínima de células bacterianas.Para uma escala comparativa de efetividade, toxicidade e especificidade, vamos tratar células em cultura positivas (PSMA+ ou CEA+) e negativas (PSMA- ou CEA-) com: 1 - Anticorpos anti-biomarcador (PSMA ou CEA) não conjugados, conjugados com grupos fluorescentes (Cy5) ou conjugados com drogas antitumorais; 2 - Bactérias programadas para lise sincronizada e 3- Bactérias programadas para lise sincronizada dirigidas por anticorpos anti-biomarcador (PSMA ou CEA). Células modelo de câncer de próstata e de câncer colorretal serão usadas.Paralelamente, através de colaborações, pretendemos desenvolver novos fragmentos de anticorpos contra o PSMA e o CEA, e futuramente contra outros biomarcadores de células tumorais e/ou biofilmes bacterianos, para estender e aplicar as tecnologias desenvolvidas. (AU)