Evaluation and optimization of SYBR Green real-time reverse transcription polymerase chain reaction as a tool for diagnosis of the Flavivirus genus in Brazil

Autor(es)

Romeiro, Marilia Farignoli ^[1] ; de Souza, William Marciel ^[1] ; Tolardo, Aline Lavado ^[1] ; Vieira, Luiz Carlos ^[1] ; Colombo, Tatiana Elias ^[2] ; Aquino, Victor Hugo ^[3] ; Nogueira, Mauricio Lacerda ^[2] ; Moraes Figueiredo, Luiz Tadeu ^[1]

Afiliação do(s) autor(es)

^[1] Univ Sao Paulo, Fac Med Ribeirao Preto, Ctr Pesquisa Virol, Sao Paulo - Brazil

^[2] Fac Med Sao Jose do Rio Preto, Lab Pesquisa Virol, Sao Paulo - Brazil

^[3] Univ Sao Paulo, Fac Ciencias Farmaceut Ribeirao Preto, Dept Anal Clin Toxicol & Bromatol, Lab Virol, Sao Paulo - Brazil

• Tipo de documento: Artigo Científico
• Fonte: Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical; v. 49, n. 3, p. 279-285, MAY-JUN 2016.
• Citações Web of Science: 2

Resumo

Abstract: INTRODUCTION: The genus Flavivirus includes several pathogenic species that cause severe illness in humans. Therefore, a rapid and accurate molecular method for diagnosis and surveillance of these viruses would be of great importance. Here, we evaluate and optimize a quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method for the diagnosis of the Flavivirus genus. METHODS: We evaluated different commercial kits that use the SYBR Green system for real-time RT-PCR with a primer set that amplifies a fragment of the NS5 flavivirus gene. The specificity and sensitivity of the assay were tested using twelve flaviviruses and ribonucleic acid (RNA) transcribed from the yellow fever virus. Additionally, this assay was evaluated using the sera of 410 patients from different regions of Brazil with acute febrile illness and a negative diagnosis for the dengue virus. RESULTS: The real-time RT-PCR amplified all flaviviruses tested at a melting temperature of 79.92 to 83.49°C. A detection limit of 100 copies per ml was determined for this assay. Surprisingly, we detected dengue virus in 4.1% (17/410) of samples from patients with febrile illness and a supposedly negative dengue infection diagnosis. The viral load in patients ranged from 2.1×107to 3.4×103copies per ml. CONCLUSIONS: The real-time RT-PCR method may be very useful for preliminary diagnoses in screenings, outbreaks, and other surveillance studies. Moreover, this assay can be easily applied to monitor viral activity and to measure viral load in pathogenesis studies. (AU)

• Processo FAPESP: 13/02256-2 - Desenvolvimento de RT-PCR em tempo real para diagnóstico de infecções por vírus Piry e outros Vesiculovirus
• Beneficiário: Aline Lavado Tolardo
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Processo FAPESP: 12/02836-6 - Desenvolvimento de técnicas de RT-PCR em tempo real para arbovírus causadores de doença humana e identificação destes com base na sequência nucleotídica
• Beneficiário: Marilia Farignoli Romeiro
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Processo FAPESP: 14/20851-8 - Estudo sobre infecções por Alphavirus e Flavivirus em amostras de Banco de Sangue
• Beneficiário: Marilia Farignoli Romeiro
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado
• Processo FAPESP: 12/24150-9 - Pesquisa de vírus em roedores silvestres, mosquitos e carrapatos
• Beneficiário: William Marciel de Souza
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado
• Processo FAPESP: 13/14929-1 - Detecção de arbovírus e outros vírus de RNA por RT-PCR em tempo real e estudo do viroma
• Beneficiário: Luiz Tadeu Moraes Figueiredo
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Processo FAPESP: 14/15079-4 - Pesquisa de virus de RNA em amostras séricas e artropodes
• Beneficiário: Luiz Carlos Vieira
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico