Increased glycosylated L-asparaginase production through selection of Pichia pastoris platform and oxygen-methanol control in fed-batches

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Parizotto, Leticia de Almeida ^[1] ; Kleingesinds, Eduardo Krebs ^[2] ; Pedrotti da Rosa, Luiza Manfrinato ^[1] ; Effer, Brian ^{[2, 3, 4]} ; Lima, Guilherme Meira ^[2] ; Herkenhoff, Marcos Edgar ^[2] ; Li, Zhaopeng ^[5] ; Rinas, Ursula ^[5] ; Monteiro, Gisele ^[2] ; Pessoa, Adalberto ^[2] ; Tonso, Aldo ^[1]

Afiliação do(s) autor(es)

^[1] Univ Sao Paulo, Polytech Sch, Dept Chem Engn, Av Prof Lineu Prestes 580, Bloco 20, BR-05508000 Sao Paulo - Brazil

^[2] Univ Sao Paulo, Sch Pharmaceut Sci, Dept Biochem Pharmaceut Technol, Sao Paulo - Brazil

^[3] Univ La Frontera, Ctr Excellence Translat Med CEMT, Temuco - Chile

^[4] Univ La Frontera, Sci & Technol Bioresource Nucleus BIOREN, Temuco - Chile

^[5] Leibniz Univ Hannover, Fac Nat Sci, Inst Tech Chem, Hannover - Germany

• Tipo de documento: Artigo Científico
• Fonte: Biochemical Engineering Journal; v. 173, SEP 2021.
• Citações Web of Science: 2

Resumo

Currently, only the biopharmaceutical L-asparaginase (ASNase), a chemotherapy agent, from bacteria is approved for clinical use. Although it is efficient, it causes severe side effects due to its origin. Therefore, new sources are investigated to reduce immunogenicity. Moreover, it is urgent to enhance protein stability, folding and kinetics with post-translational modifications, such as glycosylation. Aiming at these attributes, this study focused on the production of a glycosylated L-asparaginase of Dickeya chrysanthemi expressed by Pichia pastoris Glycoswitch (R). Producer strains of Pichia, one with auxotrophy for histidine and another prototrophic were compared by using a complex medium in flasks and a synthetic medium in a bioreactor. The prototrophic strain showed higher productivity than the auxotrophic in both scales. Following, two induction strategies with the prototrophic strain were executed: methanol pulses and a DO-stat. The latter resulted in 2-fold more maximum volumetric activity. Lastly, the glycosylation analysis of the final product showed that the site Asn(170), which is associated with allergies in patients, was glycosylated, thus, reducing potential immunogenic effects. Therefore, this study showed that the prototrophic strain was the most suitable L-asparaginase producer and that methanol-oxygen control in bioreactor enhanced the production of a glycosylated ASNase. (AU)

• Processo FAPESP: 17/20384-9 - Desenvolvimento de processo de purificação de L-asparaginase humanizada e sua caracterização
• Beneficiário: Eduardo Krebs Kleingesinds
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado
• Processo FAPESP: 18/15041-8 - Expressão de L-asparaginase de Erwinia chrysanthemi em tecnologia de síntese proteica livre de células
• Beneficiário: Guilherme Meira Lima
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Processo FAPESP: 17/25065-9 - Produção de L-asparaginase por Pichia pastoris em cultivos descontínuos-alimentados em biorreatores
• Beneficiário: Letícia de Almeida Parizotto
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
• Processo FAPESP: 13/08617-7 - Produção de L-asparaginase extracelular: da bioprospecção à engenharia de um biofármaco antileucêmico
• Beneficiário: Adalberto Pessoa Junior
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Temático
• Processo FAPESP: 19/02583-0 - Avaliação da catharina sour, primeiro estilo de cerveja brasileiro, como bebida pontencialmente probiótica, com aplicação das técnicas de pcr em tempo real e maldi-tof
• Beneficiário: Marcos Edgar Herkenhoff
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Processo FAPESP: 19/02657-3 - Produção de L-asparaginase por Pichia pastoris em cultivos descontínuos-alimentados em biorreatores
• Beneficiário: Letícia de Almeida Parizotto
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado Direto