Glycosylation of Erwinase results in active protein less recognized by antibodies

Autor(es)

Effer, Brian ; Kleingesinds, Eduardo Krebs ; Lima, Guilherme Meira ; Costa, Iris Munhoz ; Sanchez-Moguel, Ignacio ; Pessoa, Adalberto ; Santiago, Veronica Feijoli ; Palmisano, Giuseppe ; Farias, Jorge G. ; Monteiro, Gisele

• Tipo de documento: Artigo Científico
• Fonte: Biochemical Engineering Journal; v. 163, p. 11-pg., 2020-11-15.

Resumo

L-asparaginase (L-ASNase) is an important bacterial enzyme used as a biopharmaceutical to treat acute lymphoblastic leukemia (ALL). Side effects of L-ASNase therapy have been counteracted by polyethylene glycol (PEG)-modification of L-ASNase; however, immunogenicity of PEG has been observed in patients. Here we explore L-ASNase glycosylation as a biological alternative to the PEGylation industrial process. In our results, a recombinant Erwinase expressed in the Glycoswitch (R) Pichia pastoris strain occurred in three extracellular and glycosylated active variants; two tetrameric forms: Erw240 (240 kDa) and Erw160 (160 kDa), with a specific activity of 15.71 and 302.02 U mg(-1) respectively; and one monomeric version: Erw40 (40 kDa), with a specific activity of 48.45 U mg(-1). The lighter tetramer and the monomer showed a catalytic efficiency of 7.7 x 10(5) and 1.05 x 10(6) M-1 s(-1) respectively, while the heaviest form considerably lost its activity. Mass spectrometry analysis determined that Erw40 and Erw160 tetramer were N-glycosylated at Asn(170) mostly with GlcNAc(2)Man(7) N-glycans. These glycosylation sites are part of a predicted immunogenic T-cell epitope related to ASNase allergy in ALL patients. ELISA assay showed a significant reduction of antibody recognition of the glycosylated Erwinase suggesting that the glycans had a cloaking effect against antibodies. The new L-ASNase versions reported here could provide an alternative for the treatment of ALL. (AU)

• Processo FAPESP: 13/08617-7 - Produção de L-asparaginase extracelular: da bioprospecção à engenharia de um biofármaco antileucêmico
• Beneficiário: Adalberto Pessoa Junior
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Temático
• Processo FAPESP: 15/07749-2 - Engenharia de proteínas e comparação de sistemas microbianos de expressão do biofármaco L-asparaginase
• Beneficiário: Gisele Monteiro
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Processo FAPESP: 17/20384-9 - Desenvolvimento de processo de purificação de L-asparaginase humanizada e sua caracterização
• Beneficiário: Eduardo Krebs Kleingesinds
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado
• Processo FAPESP: 18/15104-0 - Ensaios pré-clínicos de proteoformas de asparaginase glicoproteicas ou resistentes a proteases séricas.
• Beneficiário: Gisele Monteiro
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Processo FAPESP: 16/15787-4 - Clonagem de L-asparaginase de Escherichia coli em linhagem de Pichia Pastoris com glicosilação humanizada
• Beneficiário: Guilherme Meira Lima
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Processo FAPESP: 16/25896-5 - Caracterização bioquímica e avaliação citotóxica de isoformas mutantes de L-Asparaginase II de Dickeya chrysanthemi (Erwinia chrysanthemi)
• Beneficiário: Iris Munhoz Costa
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado