Importância do domínio extracelular e transmembranal para ligação e ativação do receptor b1 de cininas: correlação com a estrutura-atividade do receptor at1 da angiotensina ii.

Resumo

Estudos recentes sobre a relação estrutura-atividade do receptor B1 (B1R) revelaram que os resíduos importantes para a ligação entre a des-Arg9-Bradicinina (DBK) e o B1R são homólogos aos resíduos que atuam na interação entre a angiotensina e o receptor AT1 (AT1R). O grupo amonio da Lys199 (512) localizada na hélice V do AT1R interage com a carboxila da Phe8 da AngII, por fornecer um sítio positivo importante para a ligação da porção C-terminal negativa da AngII (Noda e cols., 1995a; Yamano e cols., 1992). Por outro lado, recente trabalho sugeriu que a Lys128 e a Arg212, das hélices III e V do B1R, respectivamente, interagem com a Phe8 da DBK e a seqüência (CPYHFFAFL) da hélice VI do B1R interage com o resíduo C-terminal da DBK (Santos e cols., 2008). Como B1R e o AT1R têm agonistas com um mesmo segmento C-terminal (Pro7-Phe8), supõe-se que ambos receptores também apresentem um mesmo sitio de ligação para esta região dos agonistas no topo das hélices V e VI. Baseado nesses dados é nosso objetivo procurar outras similaridades para resíduos importantes na interação entre a DBK e o B1R através de ensaios de ligação utilizando-se os análogos da DBK que serão sintetizados e os receptores selvagem e mutantes obtidos do B1R; ou de ensaios de expressão funcional do receptor selvagem e seus mutantes, através de ensaios de produção de IP3 e dosagem de [Ca2+]I. Entre alguns objetivos específicos visados podemos citar: 1) verificar se a região N-terminal da DBK (Arg1) interage com o Asp301 (712) do B1R; (2) investigar se a Asn130 (325) do B1R, resíduo homólogo a Asn111 (325) do AT1R, interage com Phe5 da DBK, pela substituição da Asn130 por Gly; (3) avaliar o papel da segunda ponte dissulfeto do B1R pela obtenção do mutante contendo Cys25 substituído por Ser. Confirmando-se a hipótese de a Arg1 do peptídeo ser importante para interagir com a Asp301 (712) da alça EC-3 do receptor, pretende-se também verificar a importância do guanido grupo nessa posição 1 do peptídeo com o análogo [Lys1]DBK. Em casos de se encontrar mutantes com índices baixos de interação com o peptídeo selvagem, serão realizados testes de colocalização intracelular (marcação do receptor com GFP e utilização de um marcador de reticulo, calnexina) para verificar se o receptor mutado foi corretamente expresso na membrana ou se ele foi internalizado por ativação constitutiva ou foi retido no retículo endoplasmático, por deficiência na sua maturação. Além disso, se houver indícios da presença maior de receptores no interior da célula, a linhagem celular expressando esse receptor será submetida à prévio tratamento com antagonista especifico do B1R para verificar se ocorre reversão de uma possível internalização constitutiva do mesmo.