Caracterização Funcional da Dupla Mutação BRAFV600E + RET/PTC3 em Carcinoma Papilífero da Tiroide

Resumo

O Carcinoma Papilífero de Tiroide (CPT) é o subtipo histológico mais comum entre os tumores da tiroide. Alterações nos genes que codificam para a via da MAPK têm um papel crucial na sua patogênese, sendo que mutações nos oncogenes BRAF e RAS e rearranjos envolvendo o oncogene RET são as mais frequentemente encontradas. Além disso, o reconhecimento dessas alterações e os consequentes estudos de associação podem levar à escolha da terapia mais eficiente para cada paciente, principalmente no caso de terapia com drogas-alvo. Nosso grupo investigou a prevalência dos rearranjos RET/PTC e da mutação no gene BRAF V600E em uma série de CPT (n=118) e correlacionou com dados clínico-patológicos e com o perfil da expressão gênica. Nesta análise identificamos a co-ocorrência de mutação em BRAF V600E e rearranjos RET/PTC em aproximadamente 13% dos casos, sendo que a isoforma RET/PTC3 ocorreu in 87% das vezes. Estes dados tem importantes implicações clinicas com relação ao prognóstico e tratamento do paciente. Assim, por meio de análise funcional, investigaremos o efeito da presença das duas mutações nas características biológicas das células Nthy-ori 3-1 (célula folicular tiroideana normal imortalizada). Para isso as células Nthy-ori 3-1 serão transformadas com vetor de expressão pBudCE4.1 contendo cDNA de BRAF V600E e de RET/PTC3 concomitantemente e os vetores controle contendo BRAF V600E ou RET/PTC e vetor vazio. Os clones selecionados serão avaliados quanto ao efeito da dupla mutação na expressão dos genes do metabolismo do iodo NIS, TSHR, TPO, TG e PDS, bem como, na ativação das vias MAPK e PIK3/AKT/mTOR. Além disso, avaliaremos o crescimento e viabilidade, ciclo celular, apoptose e crescimento independente de ancoragem e o nível de instabilidade gênica com formação de quebras na fita dupla. Por fim, analisaremos o efeito de droga alvo para BRAF nas células com a expressão ectópica de RET/PTC3 e BRAF V600E, uma vez que foi verificado que a presença concomitante de mutações nos genes BRAF e RAS induziu resistência nos pacientes com melanoma. Essas análises permitirão melhor compreensão da patogênese do CPT, assim como na decisão da melhor terapia para os pacientes com as diferentes mutações.