Expressão gênica diferencial, análise ultraestrutural e avaliação do perfil lipídico de blastocistos bovinos produzidos in vitro a partir de oócitos maturados convencionalmente ou pelo sistema SPOM

Resumo

Na maturação in vitro (MIV) não são utilizados hormônios superestimulatórios in vivo evitando, desse modo, excessivos gastos e manipulações do animal além dos efeitos prejudiciais iatrogênicos da superestimulação ovariana. Entretanto, a eficiência dos sistemas de MIV ainda não atingem as expectativas devido à incapacidade em simular os eventos fisiológicos que ocorrem in vivo (como principal exemplo, a sincronização entre as maturações nuclear e citoplasmática do oócito). Por esta razão, o incremento dos meios de MIV é um alvo cada vez mais visado nas pesquisas da área reprodutiva. A avaliação do perfil lipídico de embriões é uma abordagem nova e, particularmente, importante para a aferição da qualidade embrionária na criopreservação. Além dos lipídios, a caracterização celular, por meio da morfologia e da distribuição das organelas, fornece resultados consistentes na caracterização do embrião, quando este é analisado ultraestruturalmente. Além disso, a expressão diferencial de genes - conhecidos como indicadores de função específica e, consequentemente, de competência embrionária - pode ser avaliada em conjunto com tais técnicas, a fim de identificar os blastocistos produzidos in vitro que possuem melhor qualidade (morfológica e fisiológica) e competência para sua posterior implantação e desenvolvimento. Portanto, o presente trabalho visa comparar o sistema de MIV convencional com um novo sistema de maturação oocitária (que simula a fisiologia do processo in vivo; SPOM) em que o uso de fármacos e o momento de sua administração são específicos (resumidamente: forskolin e IBMX na pré-maturação, por 2 h, e FSH e cilostamida nas 28 h seguintes de maturação). Oócitos maturados serão fertilizados e os blastocistos produzidos serão avaliados quanto ao perfil lipídico (espectrometria de massas MALDI-TOF-MS, Laboratório ThoMSon, Campinas), à ultraestrutura (microscopia eletrônica, Instituto de Biociências, Botucatu) e à expressão diferencial de 51 genes indicadores de qualidade e de competência embrionária (sistema microfluídico, Fluidigm). A metodologia descrita será realizada no Brasil (Instituto de Biociências, Botucatu), com animais de raça Bos indicus, e na Dinamarca (Department of Basic Animal and Veterinary Sciences, University of Copenhagen) com animais de raça Bos taurus, a fim de verificar a eficiência e a repetibilidade do sistema SPOM com diferentes cenários e genótipos. A comunhão dos dados, a serem obtidos com o presente projeto, visa fornecer um indicador geral e confiável de qualidade embrionária, que abrangesse a implantação, o desenvolvimento ou a criopreservação em rotinas comerciais de produção in vitro.