Formação de vacúolos quiméricos com Leishmania amazonensis e Trypanosoma cruzi e participação da subunidade d2 da ATPase vacuolar na biogênese dos vacúolos parasitóforos de Leishmania amazonensis

Resumo

A leishmaniose e doença de Chagas são doenças tropicais negligenciadas que afetam 20 milhões de pessoas no mundo e causam 100.000 mortes por ano, em países com baixos índices de desenvolvimento. São causadas por protozoários flagelados da família Trypanosomatidae e transmitidos ao homem a partir de insetos-vetores. A leishmaniose tem como agente causador as espécies do gênero Leishmania, que alternam entre dois principais estágios de desenvolvimento em todo seu ciclo de vida: a forma promastigota (móvel e flagelada, encontrada no inseto) e a forma amastigota (séssil e intracelular encontrada no hospedeiro mamífero). O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, cujo ciclo de vida também envolve estágios evolutivos flagelados (as formas proliferativas epimastigotas e as formas infectivas tripomastigotas) e de flagelo internalizado (as formas amastigotas). Durante o processo de invasão celular pelas diferentes formas evolutivas destes parasitas, observa-se um processo de biogênese de um vacúolo parasitóforo (VP), estrutura na qual o parasita se aloja dentro das células hospedeiras. Estas estruturas desenvolvem-se como fagolisossomos, amadurencendo a partir de fusões com endossomos primarios, secundários e lisossomos. Cada parasita intracelular "personaliza" o VP no qual está alojado, seja subvertendo o tráfego vesicular do hospedeiro ou restringindo a passagem de componentes (como enzimas e prótons) para o conteúdo do vacúolo. Estudos de coinfecção intracelular envolvendo esses dois patógenos podem responder questões relacionadas à modulação do ambiente intravacuolar do hospedeiro: a partir da formação de vacúolos quiméricos abrigando os dois parasitas. Desta forma, pretendemos investigar a influência de um vacúolo personalizado por um patógeno na sobrevida e diferenciação de um segundo patógeno cohabitante. Empregaremos a coinfecção entre L. amazonensis (amastigotas) e T.cruzi (epimastigota, tripomastigota metacíclico e derivado de cultura celular e amastigota extracelular) em macrófagos primários e de linhagem. Adicionalmente, serão depletados, destes macrófagos, vários fatores que contribuem para a biogênese dos VPs como ATPase vacuolar Atp6v02, marcador de endossoma primário Rab5a, marcador de endossomo primário EEA1, mediador de fusão entre vesículas SNAREs Vti1b, marcador de lisossomos Lamp1 e Lamp2, e formador de corpos multivesiculares Chmp4b. A função desses componentes na biogênese dos VPs de L. amazonensis e T. cruzi bem como na formação de vacúolos quiméricos contendo essas duas espécies será investigada. (AU)