Estudos funcionais e estruturais de quatro homólogos recombinantes do complexo carreador mitocondrial de piruvato

Resumo

Piruvato é o produto final da glicólise citosólica e tem um número de destinos intracelulares possíveis, sendo o principal deles a internalização mitocondrial. O transporte de piruvato através da membrana mitocondrial é um passo crítico no metabolismo energético e biossintético. Apesar de serem previstas a mais de 40 anos, somente recentemente é que as proteínas necessárias para esta atividade foram identificadas. Duas proteínas associadas à membrana mitocondrial interna (IMM), chamadas de MPC1 e MPC2, foram identificadas como as componentes essenciais para formação do complexo do transporte de piruvato em levedura (S. cerevisiae), Drosophila e humanos. Estas proteínas são preditas como possuindo três hélices transmembrana, com cada subunidade pesando 15 kDa. No entanto, de acordo com os dados relatados, acredita-se que o complexo funcional (formado pelas subunidades MPC1 e MPC2) tenha um peso molecular total de 150 KDa, como estimado por eletroforese não-desnaturante, indicando a possibilidade de uma formação de decâmeros. Embora as proteínas envolvidas no transporte de piruvato foram identificadas, questões tais como qual é a estequiometria correta entre as subunidades, quais são os papéis individuais de cada uma no complexo e quais são os determinantes moleculares do transporte do piruvato não foram abordados até o momento. A fim de contribuir na elucidação destas questões, o presente projeto propõe as caracterizações bioquímicas e biofísicas, juntamente com a possível determinação da estrutura do complexo MPC. Considerando-se que MPC é um complexo transmembrana, é de se esperar sérias dificuldades na expressão, purificação e estudos estruturais do complexo. Para este projeto de doutorado, escolhemos trabalhar com os carreadores homólogos de galinha (Gallus gallus), nematódeo (Caenorhabditis elegans), planta (Arabidopsis thaliana) and anêmona marinha (Nematostella vectensis). Para ultrapassar estas dificuldades, a expressão heteróloga em levedura será empregue como o sistema de expressão escolhido, o que pode ajudar na correta localização, enovelamento e estabilidade do complexo MPC. Além disso, a determinação do detergente ou mistura de detergentes, que irá interromper a organização das membranas plasmáticas e das organelas, sem comprometer a estrutura terciária da proteína, também necessita de ser determinado. Nesse contexto, durante o ano de 2013 nosso laboratório gerou um conjunto de resultados preliminares bastante positivos que suportam a viabilidade desta proposta. Estudos bioquímicos e biofísicos (ultracentrifugação analítica, calorimetria por titulação isotérmica, ressonância plasmônica de superfície e microscopia eletrônica por coloração negativa ou em condições criogênicas) serão realizados no complexo MPC purificado, a fim de determinar o seu peso molecular e a estequiometria exacta e arquitetura geral. Como é frequentemente no caso produção de proteinas complexas em sistemas heterólogos, assim como para aumentar as chances de sucesso na cristalização, a escolha da construção correta é a chave entre o sucesso e o fracasso. Assim, genes sintéticos do complexo (MPC1 e MPC2) de dez organismos diferentes já foram comprados. Os estudos planejados e ensaios de cristalização serão realizados para as construções mais promissoras, seguido pela determinação da estrutura de cristal do complexo MPC. O projeto proposto, uma vez concluído com êxito tem um potencial para fornecer informações valiosas na compreensão primária dos mecanismos inerentes ao transporte do piruvato citosólico através da membrana mitocondrial. (AU)