Uso do CRISPR-Cas9 na Investigação do Papel das Integrinas na Diferenciação Osteoblastica de Células-Tronco Mesenquimais Induzidas por Superfícies de Titânio

Resumo

Interações entre células e titânio (Ti) são cruciais para a osseointegração de implantes dentários. As integrinas medeiam a adesão de células às proteínas da matriz extracelular e alguns dos seus membros estão envolvidos no processo de diferenciação osteoblástica. Os resultados do projeto intitulado " Papel das integrinas na diferenciação osteoblástica de células-tronco mesenquimais induzidas por titânio com micro e nanotopografia" têm mostrado que o Ti com nanotopografia (Ti-Nano) e o Ti com microtopografia (Ti-Micro) modulam a expressão de vários genes envolvidos na via de sinalização das integrinas comparado ao Ti usinado (Ti-Usinado), com efeito mais pronunciado sobre o Ti-Nano. As integrinas beta 3, alfa 10 e alfa V estão entre as reguladas pelo Ti-Nano. Então, o objetivo desse estudo é investigar, através do silenciamento gênico por agrupados de curtas repetições palindrômicas regularmente interespaçadas / associados à nuclease 9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats / associated nuclease 9) (CRISPR-Cas9), o papel dessas integrinas na diferenciação osteoblástica induzida pelas superfícies de Ti. Para isso, células-tronco mesenquimais de ratos serão transduzidas com CRISPR-Cas9 e a eficiência de silenciamento será avaliada por PCR em tempo real e Western blot. As células transduzidas serão cultivadas sobre os discos de Ti com as três diferentes superfícies, Ti-Nano, Ti-Micro e Ti-Usinado e os seguintes parâmetros serão avaliados: (1) expressão gênica da integrina beta 3, integrina alfa 10 e integrina alfa V e dos marcadores osteoblásticos RUNX2, osterix, sialoproteína óssea e fosfatase alcalina (ALP), por PCR em tempo real aos 3 dias, (2) expressão proteica da integrina beta 3, integrina alfa 10 e integrina alfa V e RUNX2, por Western blot aos 3 dias, e (3) atividade de ALP, por Fast Red aos 10 dias. Os dados quantitativos serão obtidos em triplicata (n=3) e analisados pelo teste ANOVA One-Way com nível de significância de 5%.