Análise de alterações induzidas por fator de crescimento no proteoma nuclear ao longo do ciclo celular de células tumorais de camundongo

Resumo

Apesar de ser um fator de crescimento, o fator de crescimento de fibroblastos (FGF) 2 apresenta atividades anti-proliferativas e anti-tumorais em alguns contextos. Na linhagem tumoral adrenocortical de camundongo (linhagem Y1), FGF-2 atrasa a progressão da fase S e bloqueia, permanentemente, as células na transição G2/M do ciclo celular, levando-as à senescência. Este projeto trata-se da continuação de um projeto de doutorado direto (2015/04867-4) (realizado por 1 ano e 8 meses) com bolsa orçamentária vinculada a Projeto Jovem Pesquisador (2011/22619-7) cujo objetivo é estudar a dinâmica de modificações pós traducionais (MPTs) em histonas induzidas por este fator de crescimento. Em resumo, verificamos que o tratamento com FGF-2 causa diminuição nos níveis de acetilação de H4K16. Como esta MPT está associada a dano/reparo de DNA, investigamos, por ensaios de COMETA, que células estimuladas com FGF-2 apresentam dano no DNA possivelmente devido a geração de bases oxidadas por estresse oxidativo. Como a mitocôndria é uma das principais fontes geradoras de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) e, abriga diversas sirtuinas (enzimas envolvidas com a desacetilação de proteínas), investigamos se o FGF-2 poderia induzir alterações mitocondriais que poderiam levar a aumento de ROS e, consequentemente, gerar dano no DNA. Entretanto, não observamos aumento de ROS citoplasmático ou mitocondrial após o estímulo com FGF-2. Além disso, análises do potencial de membrana mitocondrial (TRME) e da homeostase de cálcio (Fluo-4AM) não indicaram alterações importantes na mitocôndria. Paralelamente, verificamos, por PCR quantitativo, que os níveis de expressão da enzima MOF/KAT8, responsável pela acetilação de H4K16ac, estão significativamente diminuídos após o tratamento com FGF-2. Recentemente, analisamos globalmente, por espectrometria de massas, MPTs em histonas dessa linhagem e, confirmamos a diminuição nos níveis de acetilação em H4K16 e, identificamos que H3K4me3, um importante marcador transcricional, está também diminuido após estímulo. Estas análises sugerem que o estímulo por FGF-2 induz alterações na estrutura da cromatina o que, direta ou indiretamente, poderia afetar as taxas de transcrição. Pretendemos assim, na continuação deste projeto, estender estas análises proteômicas e analisar se o estímulo com FGF-2 está induzindo alterações globais na estrutura da cromatina e nos níveis transcricionais. Além disso, pretendemos gerar células Y1 em que a expressão da enzima MOF/KAT8 esteja aumentada, ou diminuída (por ensaios de shRNA) e avaliar se a presença de altos ou baixos níveis de H4K16ac podem: I. modular a ação citotóxica de FGF-2; II. Influenciar o reparo de DNA; III. Alterar as taxas globais de transcrição e estrutura da cromatina. Em suma, acreditamos que os resultados gerados por este projeto poderão, pela primera vez, descrever alterações em MPTs em histonas induzidas por FGF-2 e possibilitar o melhor entendimento das alterações fenotípicas, que podem ser dependentes de alterações epigenéticas. Além disso, este projeto poderá ajudar a elucidar como sinais extracelulares chegam até a cromatina. (AU)