Silenciamento de RNA não-codificador (ncRNA) mediado por interferência CRISPR (CRISPRi)em cepas saprofíticas e patogênicas de Leptospira

Resumo

A leptospirose é uma zoonose de importância global recentemente incluída na lista das Doenças Tropicais Negligenciadas. Em áreas urbanas, os roedores desempenham o papel de principais reservatórios da doença por permitirem a colonização das leptospiras nos túbulos renais proximais e as excretarem vivas na urina. O gênero Leptospira engloba espécies saprofíticas e patogênicas, sendo que as últimas são o agente etiológico da doença. A geração de mutantes de Leptospira é uma peça chave na elucidação de fatores de virulência e da biologia básica da bactéria; entretanto, a recuperação de bactérias mutantes é prejudicada pelo elevado tempo de crescimento de cepas patogênicas nos meios de cultura tradicionalmente empregados. A otimização e aplicação de novos meios irá favorecer os estudos em mutagênese. Estudos recentes em Leptospira têm mostrado a expressão diferencial de RNA não codificadores (ncRNA) em condições que mimetizam a infecção no hospedeiro. Até o momento, pouco se sabe sobre a função de ncRNA em Leptospira spp. e se eles teriam um papel na virulência. O silenciamento destes ncRNA nunca foi feito nesta bactéria. A técnica de interferência CRISPR (CRISPRi) tem sido utilizada para o silenciamento específico de genes em muitos organismos e, mais recentemente, ncRNAs. Esta técnica emprega uma Cas9 cataliticamente inativa, dCas9, para causar um impedimento físico à RNA polimerase, bloqueando a transcrição. Nós aplicamos satisfatoriamente a ferramenta de CRISPRi em cepas saprofíticas para silenciamento de genes alvos, explorando novos aspectos da biologia básica das leptospiras. Porém, a ferramenta ainda não foi aplicada em cepas patogênicas, dado o elevado tempo de crescimento e formação de colônias. Com o presente projeto, pretende-se, através da otimização do meio de cultura, aplicar a ferramenta de CRISPRi a cepas patogênicas de Leptospira para silenciamento de ncRNA. A princípio, o ncRNA majoritário RNase P será usado para validação do silenciamento em cepas saprofíticas e patogênicas e, em seguida, comparação de dados de RNAseq entre cepas com perfil de virulência distinto, disponíveis no laboratório sede, serão utilizados para definir novos alvos de ncRNA diferencialmente expressos para elucidação do papel destes na virulência das leptospiras, que ainda é pouco compreendida. O efeito do silenciamento de ncRNA sobre outros genes e/ou ncRNA será avaliado por RNAseq e proteoma.