Participação da via da MAPK na aceleração da carcinogênese hepatocelular induzida pela deleção de Raptor/mTORC1 em hepatócitos

Resumo

A doença hepática não alcoólica associada à disfunção metabólica (MAFLD) é um grupo heterogêneo de doenças que engloba desde uma simples Esteatose a condições mais graves como a Esteatohepatite, Cirrose e Hepatocarcinoma Celular (HCC). A via PI3K-mTORC2-Akt-mTORC1 participa da progressão da Hepatoesteatose ao HCC e está aumentada em 40-50% dos HCC. A inibição de PTEN ativa constitutivamente a via da PI3K, e, portanto, ativa a Akt e efetores downstream, dentre eles, mTORC1. mTORC1 (complexo 1 do alvo mecanístico da rapamicina) é um sensor molecular de nutrientes e de fatores de crescimento, e componente de vias centrais de sinalização que controlam o metabolismo e sobrevivência celular, modulando processos como a síntese proteica e de lipídeos, a autofagia, bem como a estrutura e função mitocondrial. Contudo, a participação de mTORC1 no processo de instabilidade genômica associado à lipotoxicidade e estresse oxidativo que ocorre na progressão da Hepatoesteatose ao HCC é desconhecida. Para investigar o papel de mTORC1 neste processo utilizaremos camundongos com deleção de Pten exclusivamente em hepatócitos (L-PtenKO), que desenvolvem espontaneamente Esteatose, Esteatohepatite e HCC em tempos definidos (8, 24 e 48 semanas de vida, respectivamente) associado ou não com a deleção de Raptor uma proteína essencial para o funcionamento de mTORC1 (duplo knockout, L-PtenRaptorKO). Resultados parciais indicam que a deleção de Raptor em hepatócitos associada à deleção de Pten exacerba a Hepatomegalia, acelera o desenvolvimento do HCC e aumenta a fosforilação de ERK. Neste projeto, nós propomos testar a hipótese de que a deficiência de mTORC1 acelera o desenvolvimento do HCC prejudicando a síntese de triacilglicerol, o que resulta em lipotoxicidade, disfunção mitocondrial, estresse oxidativo, inflamação e assim dano no DNA por mecanismo que envolve ativação da via das MAPK. Para testar esta hipótese nós iremos realizar experimentos in vitro com hepatócitos primários isolados de camundongos com deleção de Pten associada ou não a deficiência de Raptor (mTORC1) em hepatócitos de 6 semanas de vida. Serão avaliados nestas células a sinalização intracelular na via da PI3K-mTORC2-Akt-mTORC1 (p-Akt T308 e S473, p-S6K-1 e p-S6), MAPK (p-Erk e p-Raf), e TLR-NFºB (p-IKK e p-NFºB), metabolismo de ácidos graxos (incorporação em TAG e oxidação), síntese de glicerol 3-fosfato (gliceroneogênese, glicerol quinase e glicólise curta), conteúdo de acilcarnitina, respiração mitocondrial (acoplada, desacoplada, máxima), produção de H2O2 via cadeia transportadora de elétrons e via glicerol 3-fosfato desidrogenase, autofagia e mitofagia, entre outros processos, na presença ou ausência de PD0325901, um inibidor farmacológico da MAPK. Estes mesmos parâmetros serão avaliados in vivo em (1) camundongos com deleção de Pten e Pten+Raptor em hepatócitos de 08, 24 semanas tratados ou não com PD0325901 e (2) camundongos com deleção de Raptor em hepatócitos alimentados com uma dieta rica em gordura, sacarose e colesterol combinado com o carcinogênico CCl4. Avaliaremos também no fígado destes animais, a ferroptose, perfil inflamatório (infiltração de leucócitos e conteúdo de citocinas e mediadores lipídicos como ceramidas e prostaglandinas), dinâmica, função e composição lipídica de mitocôndrias isoladas, o estado redox (produção de H2O2, conteúdo de malondialdeído [MDA] e 4-hidroxi-2-nonenal [4-HNE]) e GSH/GSSG e atividade da SOD1, catalase e GPX. Dano de DNA será avaliado por ensaio de cometa, imunohistoquímica para p53 e p-H2A.X e medida do conteúdo de 8-oxodG. Dependendo dos resultados obtidos, experimentos de fosfoproteômica serão realizados para a identificação de novos alvos de mTORC1 e das MAPK relacionados ao processos investigados. Em suma, esperamos neste estudo avançar na prospecção de novos alvos terapêuticos para tratamento do HCC. (AU)