Desenvolvimento de uma plataforma celular BoLA-null utilizando o sistema CRISPR/Cas9 para caracterização imunopeptidômica de ligantes de BoLA-DR

• Processo: 23/04771-3
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Imunologia - Imunologia Aplicada
• Pesquisador responsável: Beatriz Rossetti Ferreira
• Beneficiário: Beatriz Rossetti Ferreira
• Instituição Sede: Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto (EERP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Pesquisadores associados: Andressa Fisch ; Timothy Connelley
• Assunto(s): Biotecnologia Inovação Vacinas Desenvolvimento de vacinas Carrapatos CRISPR-Cas9 Imunopeptidômica
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Biotechnology | BoLA-DR ligands | Bovines | Immunopeptidomics | Ticks | vaccine | Biotecnologia e Inovação

Resumo

Carrapatos são parasitas complexos e vetores de doenças potencialmente letais aos bovinos, promovendo perdas significativas no setor pecuário. As vacinas anticarrapatos atualmente disponíveis induzem respostas de anticorpos específicas, mas apresentam resultados variáveis de proteção entre animais e respostas imunes de curta duração, indicando a necessidade de desenvolver vacinas mais eficientes. A sinalização de células T CD4 mediada pelo reconhecimento do TCR de peptídeos ligados a MHC II é uma etapa obrigatória para a ativação e maturação de células B em células secretoras de anticorpos, sendo essencial para o desenvolvimento de respostas eficazes de anticorpos para o controle de microrganismos e parasitas. Recentemente, a caracterização de ligantes MHC II por imuopeptidômica promoveu o desenvolvimento dos algoritmos de predição de ligantes de MHC de alta precisão. Tais ferramentas in silico aceleram a seleção racional de antígenos e epítopos para o desenvolvimento de vacinas, especialmente contra parasitas com grandes genomas (muito maiores que de humanos), como carrapatos. Nosso grupo desenvolveu uma ferramenta de predição de ligante BoLA-DRB3 para bovinos, NetBoLAIIpan, usando dados imunopeptidômicos, a qual está disponibilizada gratuitamente na internet. No entanto, os modelos celulares que empregamos não puderam ser transferidos para nosso laboratório no Brasil devido a limitações de biossegurança, impedindo o desenvolvimento de novos experimentos que pudessem expandir o banco de dados de ligantes e dar suporte às nossas pesquisas buscando uma vacina anticarrapatos. Assim, propomos produzir uma plataforma celular "BoLA-null" derivada de células de origem bovina, com expressão inativada de MHC endógeno, e validar sua capacidade de expressar alelos BoLA-DR de referência, fornecendo conjuntos de dados imunopeptidômicos confiáveis. Células de linhagem bovina MDBK serão submetidas a nocaute de MHC usando o sistema CRISPR/Cas9, e as células MHC-negativas serão usadas como hospedeiras para expressão de alelos de referência BoLA-DRB3 por transfecção plasmidial. Dados imunopeptidômicos gerados por MS/MS serão usados para treinamento de algoritmos de predição de ligantes de teste, então comparados com a ferramenta de referência NetBoLAIIpan para definir a qualidade dos dados. Se bem-sucedida, esta plataforma irá superar as limitações do modelo anterior e permitirá futuros estudos para caracterizar os motivos de ligantes dos alelos BoLA-DRB3 prevalentes em raças bovinas comerciais no Brasil. Além disso, contribuirá para uma expansão do conjunto de dados da ferramenta NetBoLAIIpan e predição de alta cobertura de ligantes em sialotranscriptomas de carrapatos, reduzindo o custo e o tempo necessários para a triagem racional de antígenos e epítopos no desenvolvimento de vacinas anticarrapatos. (AU)