Resumo
Este projeto visa estudar diferentes aspectos de reparo de DNA, assim como suas conseqüências para a célula, principalmente morte e mutagênese. Os aspectos são apresentados a seguir na forma de subprojetos, que incluem trabalhos com células de mamíferos, vegetais e bactérias. Em células de mamíferos em cultura estamos desenvolvendo sistemas de vetores virais para o controle da expressão de genes de reparo de DNA. Como modelo o gene XPA está sendo estudado. Um dos aspectos mais relevantes tem sido à busca de obtenção de mutantes dominantes negativos através de ribozimas. A expectativa é a de que a expressão do ribozimas dirigidas ao gene XPA promova alterações fenotípicas nas células, tais como redução de sensibilidade a agentes genotóxicos, como luz UV. Além disso, o gene XPA está sendo inserido em diferentes vetores com promotores que permitem o controle da expressão da proteína em células XPA, de modo a obtermos um mutante condicional de reparo de DNA. Vetores já foram construídos e as células estão sendo testadas quanto à exeqüibilidade do sistema. Estas linhagens celulares que estão sendo construídas, assim como outras já disponíveis estão sendo empregadas para se investigar os mecanismos de indução de apoptose por luz UV. Resultados iniciais realizados com células do marsupial rato canguru (linhagem PTK2) demonstraram que a morte celular induzida por luz UV é um processo ativo, envolvendo apoptose, e independente de replicação de DNA (MIYAJI e MENCK, 1995, 1996). Os dados obtidos indicaram ainda que o sinal necessário para iniciar o estímulo de apoptose por UV pode ser fotorreativado, o que permite realizar uma série de investigações interessantes da seqüência de eventos que levam a morte celular (MIYAJI e MENCK, 1996, 1998). Entretanto, estes estudos apresentam uma série de limitações, devido a não identificação de vários genes envolvidos em apoptose (por exemplo, p53, Bax, Bcl2) em células marsupiais. Nesse sentido estamos inserindo o gene da fotoliase de marsupiais em células humanas, de modo a poder empregar a fotorreativação em células melhor estudadas quanto a cascatas de eventos que resultam em apoptose. Além disso, vetores ponte de replicação epissomal, contendo diferentes mutações no gene marcador supF, estão sendo empregados para desenvolver um sistema para estudo de recombinação gênica. É nosso interesse empregar esse sistema para identificar possíveis defeitos genéticos no processo de recombinação em células humanas com mutações relacionadas a reparo de DNA. Este projeto busca também informações específicas de alguns aspectos da genética de reparo de DNA em plantas, empregando como modelo principal de estudo a cruciferaceae Arabidopsis thaliana. Estudos de reparo em vegetais são ainda incipientes, apesar de apresentarem elevado interesse pela alta exposição desses organismos a agressões do meio ambiente que resultam em lesões no DNA... (AU)
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