Estudos biofísicos e bioquímicos de proteínas mitocondriais transmembrane e suas implicações para o processo de adaptação tumoral

• Processo: 17/11766-5
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2017
• Data de Término da vigência: 31 de outubro de 2019
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
• Pesquisador responsável: Andre Luis Berteli Ambrosio
• Beneficiário: Andre Luis Berteli Ambrosio
• Instituição Sede: Instituto de Física de São Carlos (IFSC). Universidade de São Paulo (USP). São Carlos , SP, Brasil
• Assunto(s): Cristalografia de proteínas Neoplasias Proteínas de membrana transportadoras Porinas Canais de ânion dependentes de voltagem Piruvatos
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: câncer | carreador de piruvato | Metabolismo Tumoral | proteína de membrana | Cristalografia de Proteínas

Resumo

Esta proposta é dividida em duas partes principais, conforme determinado pelas proteínas de interesse: (1) cristalização e determinação da estrutura carreador mitocondrial de piruvato humano; (2) caracterização estrutural do complexo VDAC2-Bak da membrana externa mitocondrial humana por crio-microscopia eletrônica de partícula única. (1) O transporte ativo de piruvato glicolítico através da membrana mitocondrial interna (IMM) humana envolve duas subunidades carreadoras, MPC1 e MPC2, associadas em uma estrutura heterotípica oligomérica de 150 kDa. Nosso grupo demonstrou que a MPC2 humana homodimérica pode promover o transporte eficiente de piruvato em proteolipossomas reconstituídos in vitro. É importante notar que os requisitos funcionais derivados e as características cinéticas se assemelham aos já demonstrados para o transporte de piruvato em extratos mitocondriais. Nossos resultados estabelecem a estrutura inicial para explorar o papel independente da MPC2 na homeostase e doenças relacionadas à desregulação do metabolismo do piruvato. No entanto, para a desrição das base moleculares do transporte de piruvato, a determinação da estrutura atômica da MPC2 humana torna-se de grande importância. Neste contexto, propõe-se continuar a nossa colaboração bem sucedida com o Laboratório de Proteínas de Membranas (MPL), a fim de cristalizar MPC2 e coletar dados de difração de raios-X usando instalações de última geração e abordagens experimentais. A experiência adquirida trará benefícios na area de fronteira da biologia estrutural de proteínas de membrana.(2) Também conhecidas como porinas mitocondriais, VDACs (voltage-dependent anion-selective channel) são as proteínas integrais mais abundantes na membrana externa mitocondrial e considerada um novo alvo para medicamentos anti-cancer. Bak (Bcl-2-homologous antagonist/killer) pertence aos membros pro-apoptóticos da família de proteínas Bcl-2 e é constitutivamente integrada na membrana externa mitocondrial. Em células saudáveis, VDAC2 e Bak estão formam um complexo onde Bak aparece inativado ou reprimido. Os mecanismos de associação e dissociação do complexo VDAC2-Bak estão intimamente relacionados com a via apoptótica mitocondrial. Estudos demonstraram que a interferência neste complexo induz a morte celular programada em melanoma, um tipo de câncer com alta resistência às quimioterapias tradicionais e onde a deficiência homozigótica VDAC2 é letal para embriões de camundongo. Embora haja uma compreensão razoável do mecanismo regulatório de Bak, pouco se sabe sobre as funções do complexo VDAC2-Bak. Este projeto visa estabelecer bases para a investigação estrutural do complexo formado por VDAC2 e Bak e obter informações estruturais pelo método crio-microscopia eletrônica (Cryo-EM) por análise de partículas únicas. Para isso, as linhas celulares heterólogas serão estabelecidas para a produção de VDAC2 e Bak recombinantes, visando a subsequente purificação do complexo alvo. Após a purificação, as condições de investigação para o complexo por Cryo-EM serão inicialmente definidas pela técnica de coloração negativa (negative staining) e, em seguida, preparada em gelo amorfo). A obtenção de imagens do complexo puro permite o processamento pela técnica de Análise de Partículas Únicas. O modelo estrutural do complexo contribuirá na elucidação de como Bak interage estruturalmente com VDAC2, abrindo caminho para futuros estudos de utilização do complexo como alvo terapêutico. (AU)

Publicações científicas

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

QUESNAY, JOSE EDWIN NECIOSUP; POLLOCK, NAOMI L.; NAGAMPALLI, RAGHAVENDRA SASHI KRISHNA; LEE, SARAH C.; BALAKRISHNAN, VIJAYAKUMAR; DIAS, SANDRA MARTHA GOMES; MORAES, ISABEL; DAFFORN, TIM R.; AMBROSIO, ANDRE LUIS BERTELI. Insights on the Quest for the Structure-Function Relationship of the Mitochondrial Pyruvate Carrier. BIOLOGY-BASEL, v. 9, n. 11, NOV 2020. (14/20673-2, 17/11766-5, 19/02261-2, 13/07600-3, 14/06954-9, 18/00492-4, 17/02391-8, 15/02734-7)

DE GUZZI CASSAGO, CAROLINA APARECIDA; DIAS, MARILIA MEIRA; PINHEIRO, MATHEUS PINTO; PASQUALI, CAMILA CRISTINA; SILVA BASTOS, ALLINY CRISTINY; ISLAM, ZEYAUL; CONSONNI, SILVIO ROBERTO; DE OLIVEIRA, JULIANA FERREIRA; GOMES, EMERSON MACHI; RODRIGUES ASCENCAO, CAROLLINE FERNANDA; et al. Glutaminase Affects the Transcriptional Activity of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma (PPAR gamma) via Direct Interaction. BIOCHEMISTRY, v. 57, n. 44, p. 6293-6307, NOV 6 2018. (14/20673-2, 11/10127-2, 17/11766-5, 16/22246-0, 15/25832-4, 10/13992-3, 14/19518-2, 11/13981-4)