Estudo e desenvolvimento de proteinas de fusao para o transporte intracelular de vetores nao-virais atraves de proteinas motoras.

• Processo: 08/53876-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Jovens Pesquisadores
• Data de Início da vigência: 01 de julho de 2008
• Data de Término da vigência: 31 de janeiro de 2011
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica
• Pesquisador responsável: Adriano Rodrigues Azzoni
• Beneficiário: Adriano Rodrigues Azzoni
• Instituição Sede: Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 07/58323-9 - Estudo e desenvolvimento de proteínas de fusão para o transporte intracelular de vetores não virais através de proteínas motoras, AP.JP
• Assunto(s): Terapia genética
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Motores Moleculares | Terapia Genica | Vacinacao Por Dna | Vetores Nao Virais

Resumo

A baixa eficiência de transferência gênica é um problema recorrente na utilização de vetores não-virais em estudos de terapia gênica e vacinação por DNA. Essa limitação provém principalmente da dificuldade de transporte do DNA estrangeiro do exterior para o núcleo das células alvo devido à presença de inúmeras barreiras físicas, enzimáticas e difusionais. O principal objetivo do projeto aqui proposto é o desenvolvimento de proteínas recombinantes de fusão capazes de interagir e facilitar o transporte intracelular de vetores plasmídicos (pDNA) explorando-se a capacidade natural de proteínas motoras (como a Dineína) para o transporte de cargas da periferia para o interior (centrossoma) de células de mamífero. Proteínas de fusão contendo domínios N-terminais de ligação à Dineínas e domínios ou seqüências C-terminais de ligação ao DNA (5 a 16 resíduos de aminoácidos básicos) serão primeiramente clonadas e produzidas em E. coli. As interações proteínas de fusão-pDNA serão então avaliadas em ensaios in vitro e por transfecções de células de mamífero em cultura, através da quantificação da expressão do gene repórter GFP (presente no plasmídeo) por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo. O tráfego intracelular dos complexos será estudado por hibridização in situ de fluorescência (FISH). Espera-se facilitar o tráfego intracelular do pDNA através de interações com Dineínas, além da translocação do pDNA para o núcleo. Uma conseqüência esperada deste projeto é o desenvolvimento de carreadores protéicos capazes de reduzir o "gap" que diferencia atualmente os vetores não virais dos virais, além de proporcionar melhor compreensão do papel de proteínas motoras como a Dineína no tráfego intracelular de transgenes. (AU)