| Processo: | 10/05043-1 |
| Modalidade de apoio: | Bolsas no Brasil - Doutorado Direto |
| Data de Início da vigência: | 01 de junho de 2010 |
| Data de Término da vigência: | 31 de agosto de 2012 |
| Área de conhecimento: | Ciências Biológicas - Microbiologia - Biologia e Fisiologia dos Microorganismos |
| Pesquisador responsável: | Maurício Lacerda Nogueira |
| Beneficiário: | Ana Theresa Silveira de Morais |
| Instituição Sede: | Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP). São José do Rio Preto , SP, Brasil |
| Assunto(s): | Vírus da febre amarela Interações hospedeiro-parasita Proteínas recombinantes Células HeLa Cromatografia líquida Dicroísmo circular Infravermelho |
| Palavra(s)-Chave do Pesquisador: | Interação vírus-hospedeiro | Proteína humana eIF3L | Proteína NS5 FV | Virologia |
Resumo Introdução. A febre amarela é uma doença causada pelo vírus da febre amarela (YFV-yellow fever virus), gênero Flavivirus, transmitido a vertebrados através da picada de vetores artrópodes. O genoma viral origina proteínas virais estruturais e não-estruturais (destaca-se a NS5, proteína mais conservada dentre os Flavivirus e que apresenta duas atividades essenciais durante a replicação viral, uma de RNA Polimerase dependente de RNA e outra de metiltransferase). Assim, interações entre proteínas celulares e a NS5 vêm sendo estudadas com o intuito de se compreender melhor o mecanismo de replicação e patogênese de vários membros da família Flaviviridae,e conseqüentemente para o desenho racional de drogas. Através de screening em sistema duplo-híbrido em levedura contra biblioteca de cDNA de células Hela, foi demonstrado através da ativação de genes repórteres que o domínio RNApol (Fragmento A) da NS5 interage com a proteína humana eIF3L. Objetivos. Caracterizar a interação entre o domínio RNA polimerase da proteína N5S do vírus da febre amarela e a proteína celular eIF3L, com mapeamento da interação, confirmação e localização da interação NS5-eIF3L em culturas celulares e in vitro; avaliar a influencia de eIF3L na replicação viral; caracterizar biofisicamente a proteína eiF3L. Materiais e Métodos. 1)Mapeamento. A proteína eIF3L será testada para interação com RNApol e Frag A(RNApol) em levedura. Será gerado um modelo estrutural do domínio RNApol para análise da localização do FragA. Para delimitar o domínio mínimo de interação entre RNApol e eIF3L, o FragA será subdividido em três segmentos os quais serão amplificados e clonados em pGBKT7 para transformação seqüencial com pACT2- eIF3L em ensaios de duplo-híbrido. Para avaliação dos resíduos críticos de NS5 para a interação com eIF3L, será induzida mutações sítios dirigida em NS5 analisadas em duplo-híbrido.2)Interação em Culturas Celulares. Para confirmar que a interação NS5-eIF3L forma um complexo in vivo, o teste de co-imunoprecipitação das proteínas NS5 e eIF3L será realizado usando células Hela transfectadas com plasmídeos eIF3L-FLAG e NS5-HA e analisados por Western blotting. Para localizar a interação NS5-eIF3S6IP na célula, será realizado o teste de Imunofluorescência, usando plasmídeos eIF3L-FLAG e NS5-HA transfectados em células Hela. 3)Interação in vitro (GST-pulldown). A eIF3L foi clonada num vetor contendo etiqueta GST e NS5 radiomarcada clonada num vetor contendo etiqueta HA. A proteína quimérica GST-eIF3L será imobilizada em coluna seguida da adição de NS5 radiomarcada e a interação será analisada por Western blotting. 4) Para avaliar o efeito de eIF3L na produção do vírus da Febre Amarela e influência na síntese de fitas positivas e negativas do vírus, serão geradas células estáveis da linhagem LLC-MK2 (células renais de macaco rhesus) eIF3L Knock-down (eIF3L KD) e over-expressando eIF3L (eIF3L OE), para posterior infecção com 0,1MOI de YFV e análise por PCR em tempo real. 5) Expressão, purificação e renaturação in vitro da proteína eIF3L. Será realizada a expressão em escala quantitativa para futuros ensaios de caracterização espectroscopicas. A proteína recombinante será, purificada por técnicas cromatográficas inicialmente por afinidade como, por exemplo, a resina níquel para proteínas His-tagged. Caso a proteína esteja presente como corpo de inclusão após a expressão, será feita uma solubilização com um tampão contendo uréia ou cloreto de guanidina e, então, submetida a métodos de purificação por cromatografia líquida. Em seguida, a amostra purificada será submetida às tentativas de reenovelamento usando um conjunto de soluções contendo uma variedade de aditivos através do método da diluição. A concentração da proteína será determinada através da medida de absorbância da mesma a 280 nm. Uma vez obtidas quantidades suficientes, as amostras serão submetidas à caracterização biofísica por dicroismo circular e infravermelho. | |
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