Duplo papel da Amastina durante a invasão celular de amastigota extracelular e multiplicação intracelular do Trypanosoma cruzi in vitro e in vivo

• Processo: 10/13468-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Data de Início da vigência: 01 de março de 2011
• Data de Término da vigência: 31 de dezembro de 2011
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
• Pesquisador responsável: Renato Arruda Mortara
• Beneficiário: Mário Costa Cruz
• Instituição Sede: Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 06/61450-0 - Estudos moleculares do Trypanosoma cruzi e de sua interação com células e fatores do hospedeiro in vitro e in vivo, AP.TEM
• Assunto(s): Biologia celular Invasão celular Análise de sequência com séries de oligonucleotídeos Trypanosoma cruzi
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Amastina | cruzi | invasão | T | Biologia Celular

Resumo

No intuito de selecionar moléculas que estivessem envolvidas na invasão celular foi utilizado o microarranjo de cDNA de amastigotas extracelulares das cepas G e CL de Trypanosoma cruzi, que identificou a P21 como um possível modulador positivo da infectividade da cepa G. Contudo, ainda não havia sido investigada a possível existência de moduladores negativos da invasão que poderiam ser mais abundantes nos amastigotas menos infectivos (cepa CL). Na análise do microarranjo foi identificada uma glicoproteína de superfície, altamente expressa nos amastigotas, denominada amastina; uma de suas cópias é 21 vezes mais expressa na cepa CL. Aventou-se assim a possibilidade de que esta proteína estaria relacionada com a modulação negativa da invasão celular dessas formas. Desta forma, com o objetivo de determinar a função da amastina no ciclo de vida do parasito decidimos clonar, expressar e purificar a região menos hidrofóbica da amastina em fusão com GST, para produção da proteína de fusão GST-AmastinaH contra a qual se produziu um anticorpo policlonal em coelho. Este possibilitou a imunolocalização da amastina nos amastigotas de T. cruzi e confirmou sua localização na membrana do parasita. A proteína recombinante foi capaz de aderir a células HeLa de forma dose-dependente e saturável, e quando células HeLa foram pré incubadas com 5 µg/ml de proteína recombinante observamos uma diminuição da invasão celular pelas formas AE. Para confirmar o papel da amastina no ciclo celular dos amastigotas de T. cruzi, parasitas da cepa G foram transfectados com os vetores pTREX-amastina-GFP e pTREX-GFP (controle), por meio do qual foi verificada uma significativa diminuição na invasão celular dos AE que super-expressam a amastina em relação ao controle. Entretanto, o número de tripomastigotas liberados no sobrenadante das células HeLa infectadas 96h e 120h após a invasão foi maior nas células infectadas com os parasitas que super expressam a amastina. Experimentos in vivo sugeriram que a amastina está relacionada com a maior taxa de multiplicação dos AEs de T. cruzi. Como resultado, a amastina pode compensar a menor taxa de infectividade e proporcionar um ambiente mais propício para a multiplicação e diferenciação do parasita proporcionando uma infecção patente.