Papel de glutarredoxinas 1 e 2 de Saccharomyces cerevisiae em modificações redox pós-traducionais.

• Processo: 11/19155-9
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de novembro de 2011
• Data de Término da vigência: 31 de outubro de 2012
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Metabolismo e Bioenergética
• Pesquisador responsável: Luis Eduardo Soares Netto
• Beneficiário: Daiane Pereira de Oliveira
• Instituição Sede: Instituto de Biociências (IB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 07/58147-6 - Aspectos biológicos de tióis: estrutura protéica, defesa antioxidante, sinalização e estados redox, AP.TEM
• Assunto(s): Saccharomyces cerevisiae
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Glutarredoxina | glutationilação | Saccharomyces cerevisiae | tiol | biologia redox

Resumo

Muitas vias de sinalização redox são mediados por proteínas com cisteinas reativas. Dentre essas proteínas, glutarredoxinas (Grxs) são proteínas de baixo peso molecular (9-13kDa) que possuem resíduos de cisteína altamente conservados em seus sítios ativos e sítio de ligação para glutationa. Essas oxidorredutases tiólicas são capazes de reduzir pontes dissulfeto intra e inter-moleculares em proteínas alvo e também dissulfetos mistos entre proteínas alvo e glutationa. Grxs estão envolvidas em vários processos vitais para as células, como a síntese de DNA, regulação dos fatores de transcrição, controle do ciclo celular e defesa antioxidante, embora pouco se conheça sobre essas proteínas em comparação com oxidorredutases análogas, as tiorredoxinas. Na levedura Saccharomyces cerevisiae, foram identificadas oito glutarredoxinas. Glutarredoxina 1 (ScGrx1), Glutarredoxina 2 (ScGrx2) e Glutarredoxina 8 (ScGrx8) são proteínas com duas cisteínas catalíticas (ditiólicas), enquanto as outras cinco glutarredoxinas possuem apenas uma cisteína envolvida no ciclo catalítico (monotiólicas).O objetivo deste projeto é a caracterização do papel de ScGrx1 e ScGrx2 em modificações pós-traducionais de proteínas de Saccharomyces cerevisiae. Para atingir esse objetivo duas estratégias serão seguidas: (i) identificação de proteínas alvo da redução por ScGrx1 e ScGrx2 da levedura S. cerevisiae, assim comoe (ii) investigação r do efeito da expressão das proteínas selvagens e mutantes ScGrx1-S23I e ScGrx2-A23I com distintas atividades monotiólicas sobre o nível de proteínas glutationiladas na célula.Este projeto está inserido em uma linha de pesquisa do projeto Temático "Aspectos Biológicos de Tióis: Estrutura Protéica, Defesa Antioxidante, Sinalização e Estados Redox" (processo 2007/58147-6) que envolve a caracterização estrutural e funcional de glutarredoxinas de levedura. Diferentemente de outras tiol-dissulfeto óxido-redutases, como tiorredoxinas, pouco se sabe sobre essas enzimas, particularmente sobre seus alvos em células eucarióticas. Descrevemos as estruturas cristalográficas de ScGrx2 nas formas de dissulfeto intramolecular e complexada ao seu redutor biológico (glutationa), a 2.05 Å e 1.91 Å de resolução, respectivamente. Comparações com as estruturas de ScGrx1 revelaram importantes aspectos do mecanismo de ação dessas enzimas (Discola et al., 2009). Entre outros pontos, observamos que resíduos na posição 23 de ScGrx1 e ScGrx2 são importantes para a atividade monotiólica. Dados não publicados de nosso grupo mostraram que a inserção de uma isoleucina nessa posição (como presente em Grx1 de Homo sapiens) aumenta a atividade monotiólica de ScGrx1 em duas ordens de grandeza, o que deve ter grande impacto no nível de proteínas glutationiladas em leveduras.Para avançar na identificação de alvos biológicos de ScGrx1 e ScGrx2, expressaremos em diferentes linhagens de levedura proteínas mutantes que levam à formação de dissulfetos mistos estáveis (ScGrx sem a cisteína de resolução) ou que aumentam a atividade de redução de dissulfetos mistos com glutationa por meio da atividade monotiólica (ScGrx com isoleucina na posição 23). Por espectrometria de massas, pretendemos identificar alvos da redução por ScGrx1 e ScGrx2. Pretendemos, ainda, analisar os níveis de proteínas glutationiladas em leveduras que expressam ScGrx com isoleucina na posição 23 e respectivas proteínas selvagens. A detecção quantificação do conteúdo total dee proteínas glutationiladas se dará por Western blot, utilizando anticorpo contra glutationa ou por redução com NaBH4, seguida precipitação ácida de proteína e análise com reagente de Elman (DTNB = ácido 5,5-ditiobis (2-nitrobenzóico)).