Busca avançada
Ano de início
Entree

Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para o monitoramento dos produtos das vias metabólicas do triptofano em linhagem celular de glioma humano

Processo: 12/00764-8
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado Direto
Vigência (Início): 01 de junho de 2012
Vigência (Término): 15 de março de 2015
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Farmácia
Pesquisador responsável:Ernani Pinto Junior
Beneficiário:Ariane Rivellis Júlio
Instituição-sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Química analítica   Triptofano   Linhagem celular   Glioma   Cromatografia líquida de alta eficiência

Resumo

Este estudo tem como objetivo o desenvolvimento de métodos bioanalíticos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) bidimensional para a determinação quantitativa e simultânea dos metabólitos do triptofano (TRP), incluindo aqueles das vias das quinureninas (via KYN), serotoninérgica (via SER) e das triptaminas (incluindo dimetiltriptamina, DMT). Serão utilizados diferentes tipos de detecção: (i) por arranjo de diodos (DAD); (ii) fluorescência (FD) e (iii) espectrometria de massas (MS). A validação dos métodos seguirá as especificações da Resolução RE nº 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA. Como matriz biológica, serão utilizadas culturas celulares de gliomas da linhagem A172. Além do desenvolvimento de métodos utilizando cromatografia bidimensional para a detecção simultânea dos analitos de interesse, métodos de extração também serão otimizados para a concentração dos metabólitos presentes nos sobrenadantes e homogenatos celulares. A investigação do catabolismo do TRP e formação de metabólitos são de grande relevância, pois vários dos compostos presentes nessas vias atuam sobre processos de imuno escape de tumores, tolerância e imunomodulação. A confirmação da presença de alguns dos metabólitos e determinação de suas concentrações em fluidos biológicos pode ser de grande valia para o prognóstico de diversas doenças. Adicionalmente, resultados recentes do grupo colaborador (Laboratório de Bioquímica Clínica FCF-USP) evidenciam que há um cross-talking entre as vias de metabolização do TRP e que vários outros metabólitos afetam o crescimento de tumores. Desta forma, há interesse no desenvolvimento de metodologias analíticas seletivas e sensíveis para acompanhar e evidenciar a formação dos produtos do metabolismo do TRP. Para que as vias sejam evidenciadas, será utilizado TRP marcado com isótopos estáveis (13C e deutério - D) em diferentes posições em sua estrutura e os produtos serão monitorados por LC-MS/MS (Ion trap e Q-TOF). A escolha da linhagem de glioma A172 é em razão das rotas de catabolismo do TRP, via KYN e via das triptaminas, estarem ativas nestas células, o que a torna uma excelente matriz para o desenvolvimento do método. Além disso, a via KYN, conduzida pela enzima indolamina 2,3 dioxigenase (IDO), é intensamente aumentada na presença de interferon gama (IFN-gama). Essa linhagem oferece condições adequadas para o desenvolvimento de novos métodos bioanalíticos seletivos, robustos e sensíveis para o estudo da metabolização de TRP. (AU)