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Antígenos variantes na imunidade contra Plasmodium no modelo murino: estimando a influência de proteínas variantes na citoaderência e seu potencial como vacina usando novos meios de administração

Processo: 12/18617-1
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado
Vigência (Início): 01 de janeiro de 2013
Vigência (Término): 31 de dezembro de 2016
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
Pesquisador responsável:Gerhard Wunderlich
Beneficiário:Wesley Luzetti Fotoran
Instituição-sede: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Lipossomos   Nanotecnologia   Vacinas   Bioengenharia

Resumo

Todas as espécies pesquisadas do protozoário causador da malaria Plasmodium possuem famílias gênicas que codificam antígenos secretados para a hemácia infectada. Enquanto muitos membros da família var de Plasmodium falciparum que codificam os antígenos PfEMP1 são responsáveis pela citoaderência da hemácia infectada, a mesma propriedade foi recentemente proposta para membros da superfamília pir (Plasmodium interspersed repeats) de P. vivax. P. berghei que infecta roedores possui a família multigênica bir que codificam os antígenos BIR e linhagens deste parasita também mostram o efeito de citoaderência e sequestro em capilares profundos levando a um fenômeno parecido com malaria cerebral humana. Entretanto, não conhecemos o papel de antígenos BIR neste processo patológico. A regulação da expressão dos genes bir também é desconhecido. Neste projeto, colocamos como hipótese principal i) que há uma participação de antígenos BIR na virulência/citoaderência observada em camundongos e ii) que os genes bir são regulados de forma especial havendo possivelmente um crosstalk entre loci de genes bir ativos e silenciados. Para comprovar ou rejeitar nossa hipótese propomos transfectar um cromossomo artificial contendo um lócus bir controlando a expressão de um gene reporter (GFP) ou um gene de fusão GFP-TgDHFR (confere resistência a pirimetamina) em P. berghei. Transfectantes carregando cromossomos artificiais recombinantes serão infundidos em camundongos C57bl/6 e depois selecionados por pressão da droga pirimetamina. A transcrição de genes bir será monitorada por sequenciamento maciço de próxima geração ou por análise especifica de grupos de genes bir por RT-PCR e sequenciamento de fragmentos clonados identificando os genes bir transcritos em relação ao transcrito gfp. Em paralelo tentamos observar se parasitas que expressem GFP desenvolvem malaria cerebral e se parasitas verdes acumulam ou evadem especificamente os vasos capilares do cérebro. Utilizando o parasita que possui GFP fusionado a TgDHFR monitoraremos se parasitas sob seleção constante deixam de causar malaria cerebral neste modelo o que mostraria indiretamente i) uma influência de antígenos BIR no processo e ii) que a transcrição forçada de um lócus bir artificial interfere na transcrição de outros genes bir. Em paralelo, transfectantes também serão infundidos em camundongos transgênicos para GFP. Segundo nossa hipótese, a transcrição de gfp deve ser modulada de forma diferencial comparado com o camundongo wildtype em função do desenvolvimento imunológico contra o antígeno em ambiente tolerante a ele (C57BL/6 transgênico para GFP) ou resistivo ao antígeno exógeno (wildtype). As mesmas construções podem ser aplicadas no modelo P. berghei de malaria gestacional desenvolvido por um colega no departamento. Em paralelo, testaremos se nanoparticulas dirigidas são superiores como vacina comparado com vacinas convencionais. Para isso, antígenos vacinais serão expressos de forma recombinante em sistema eucarioto contendo uma âncora GPI que posteriormente possibilitará a inserção em lipossomos. Os lipossomos ainda podem ser tornados dirigíveis pela inserção de ligantes a receptores específicos e os lipossomos multicamadas em si podem ser ainda carregados com substâncias efetoras solúveis. Inicialmente usaremos a proteína PfRh5 de P. falciparum que é um forte candidato a vacina. Como controle de carregamento e também como imunógeno será utilizada GFP ancorada com GPI. No caso de identificação de um antígeno bir associado a citoaderência em modelo gestacional ou cerebral, o respectivo antígeno BIR recombinante será incorporado como versão GPI ancorada. O sucesso da formulação é comparado em imunizações com nanopartículas/lipossomos e adjuvantes comuns como hidróxido de alumínio, adjuvante de Freund ou monophosphoryl lipid A (MPLA) e o tipo de resposta será medido por Western Blot, fenotipagem de anticorpos e titulação sorológica por ELISA.

Publicações científicas
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
FOTORAN, WESLEY L.; SANTANGELO, RACHELE; DE MIRAND, BEATRIZ N. M.; IRVINE, DARRELL J.; WUNDERLICH, GERHARD. DNA-Loaded Cationic Liposomes Efficiently Function as a Vaccine against Malarial Proteins. MOLECULAR THERAPY-METHODS & CLINICAL DEVELOPMENT, v. 7, p. 1-10, DEC 2017. Citações Web of Science: 3.
FOTORAN, WESLEY L.; COLHONE, MARCELLE C.; CIANCAGLINI, PIETRO; STABELI, RODRIGO G.; WUNDERLICH, GERHARD. Merozoite-Protein Loaded Liposomes Protect against Challenge in Two Murine Models of Plasmodium Infection. ACS BIOMATERIALS SCIENCE & ENGINEERING, v. 2, n. 12, p. 2276-2286, DEC 2016. Citações Web of Science: 2.
Publicações acadêmicas
(Referências obtidas automaticamente das Instituições de Ensino e Pesquisa do Estado de São Paulo)
FOTORAN, Wesley Luzetti. Análise do papel de genes bir no processo adaptativo ao hospedeiro e desenvolvimento de proteolipossomos para potencial uso vacinal com foco em reinvasão sanguinea de Plasmodium.. 2017. Tese de Doutorado - Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Ciências Biomédicas São Paulo.

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