Desenvolvimento e utilização de técnicas de fluorescência para o estudo de alterações conformacionais em proteínas

• Processo: 14/00661-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 11 de agosto de 2014
• Data de Término da vigência: 20 de julho de 2015
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular
• Pesquisador responsável: Vitor Marcelo Silveira Bueno Brandão de Oliveira
• Beneficiário: Marcelo Ferreira Marcondes Machado
• Supervisor: Jaap Broos
• Instituição Sede: Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: University of Groningen, Holanda
• Vinculado à bolsa: 11/20941-9 - Desenvolvimento e utilização de técnicas de fluorescência para o estudo de alterações conformacionais em proteínas, BP.PD
• Assunto(s): Enzimologia
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: aminoácidos não naturais | hetero-FRET | homo-FRET | mutações pontuais | p nitro fenilalanina | Enzimologia

Resumo

O principal objetivo do presente projeto é o desenvolvimento e aplicação de técnicas utilizando ensaios de fluorescência visando o estudo de alterações conformacionais em proteínas, mais especificamente em enzimas proteoliticas. Pretendemos usar como primeiro alvo a timet oligopeptidase (TOP, EC 3.4.24.15), sendo que esta enzima pode sofrer alterações conformacionais devido à interação com substratos ou inibidores. A estrutura dessa peptidase apresenta dois domínios compostos praticamente por estruturas alfa-hélice, sendo que, entre estes dois domínios forma-se um "profundo canal" onde o sítio ativo fica localizado, e que pode se fechar ao redor do substrato durante a catálise. TOP mutantes serão preparadas com a introdução por mutação sítio dirigida de um par de sondas, ficando uma de cada lado do canal central presente na estrutura da TOP. Tais sondas poderão ser: resíduos de triptofano (doadores de fluorescência) ou resíduos de aminoácidos não naturais (doadores ou aceptores de fluorescência), e o desenvolvimento da metodologia para a introdução de tais resíduos de aminoácidos não naturais em posições específicas nessas proteínas, é na verdade, por si um dos grandes objetivos do presente projeto. Subseqüentes experimentos de fluorescência no estado estacionário e fluorescência resolvida no tempo serão então realizados na presença de diferentes substratos e inibidores desta peptidase, para se analisar o movimento de "fechamento" do canal ao redor do ligante no centro ativo. (AU)

Publicações científicas

(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)

OLIVEIRA-SOUZA, WELLINGTON P.; BRONZE, FELLIPE; BROOS, JAAP; MARCONDES, MARCELO F. M.; OLIVEIRA, VITOR. On the efficient bio-incorporation of 5-hydroxy-tryptophan in recombinant proteins expressed in Escherichia coli with T7 RNA polymerase-based vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 492, n. 3, p. 343-348, OCT 21 2017. (14/20847-0, 11/20941-9, 14/00661-0)

MARCONDES, M. F. M.; ALVES, F. M.; ASSIS, D. M.; HIRATA, I. Y.; JULIANO, L.; OLIVEIRA, V.; JULIANO, M. A.. Substrate specificity of mitochondrial intermediate peptidase analysed by a support-bound peptide library. FEBS OPEN BIO, v. 5, p. 429-436, 2015. (12/50191-4, 11/51718-3, 11/20941-9, 14/00661-0)

MARCONDES, MARCELO F. M.; SANTOS, GABRIEL S.; BRONZE, FELLIPE; MACHADO, MAURICIO F. M.; PEREZ, KATIA R.; HESSELINK, RENSKE; DE VRIES, MARCEL P.; BROOS, JAAP; OLIVEIRA, VITOR. Probing the Conformational States of Thimet Oligopeptidase in Solution. INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES, v. 23, n. 13, p. 18-pg., 2022-07-01. (14/00661-0, 11/20941-9, 20/09678-3, 18/09158-0, 11/51989-7)