Incorporação sítio específica de aminoácidos não naturais em proteínas: desenvolvimento de novas tecnologias de incorporação e aplicação no estudo de proteínas

Resumo

Nesses últimos 4 anos temos trabalhado nas técnicas de incorporação sítio-específica de resíduos de aminoácidos não naturais em proteínas. Para isso duas metodologias estão sendo desenvolvidas paralelamente: -a primeira é a introdução de análogos de triptofano (5-Fluor-Trp, 5-hidroxi-Trp, 7-aza-Trp, 5-bromo-Trp e 5-nitro-Trp) no lugar dos resíduos de Trp, em cepas de E. coli compatíveis com os vetores que utilizam a T7 polimerase (expressão através do forte promotor T7). Os mais conhecidos e utilizados são os vetores comerciais pET (Novagen - Merck Millipore); -a segunda é a introdução de resíduos de aminoácidos não naturais utilizando-se um par ortogonal tRNA - tRNA-sintetase modificados, para a incorporação do aminoácido p-nitro-fenilalanina (sonda aceptora de fluorescência) no lugar de um dos códons de parada (UAG - amber códon), introduzido na posição desejada no gene da proteína de interesse por mutação sítio-dirigida. A princípio a aplicação dessas tecnologias será no estudo da relação estrutura-atividade da peptidase timet oligopeptidase tentando-se relacionar as alterações conformacionais que esta peptidase pode sofrer devido à interação de um ligante em seu centro de catálise. Tais objetivos são descritos em maiores detalhes no projeto. Porém, a escolha dessa peptidase como o primeiro alvo desse estudo se deu devido às características dos aminoácidos não naturais escolhidos (sondas espectroscópicas), mas principalmente devido a nossa experiência no estudo dessa peptidase, inclusive através de mutantes. Entretanto, como temos tido sucesso na incorporação tanto dos análogos de triptofano como do resíduo de p-nitro-fenilalanina, outras proteínas alvo e outras aplicações estão sendo preparadas. Exemplos: outras peptidases que podem sofrer grandes alterações conformacionais durante a catálise; inibidores protéicos de serino peptidases (serpinas) e anticorpos recombinantes que poderão servir em análises diagnósticas ou mesmo para marcação/localização in vivo; e proteínas de membrana. E também a obtenção das construções necessárias para incorporação de outros resíduos de aminoácidos não naturais também está em desenvolvimento. Exemplos: aminoácido coumarínico (sonda fluorescente), p-azido-fenilalanina e p-benzoil-fenilalanina (grupos foto-reativos) que podem ser utilizados para marcação específica ou para estudos de interações proteína-proteína. (AU)