Clonagem e expressão do biofármaco recombinante L-asparaginase de Escherichia coli com cauda ELP-intein

• Processo: 14/02782-9
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de maio de 2014
• Data de Término da vigência: 30 de abril de 2015
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Farmacologia - Farmacologia Bioquímica e Molecular
• Pesquisador responsável: Gisele Monteiro
• Beneficiário: Lucas Fonseca Gonzaga
• Instituição Sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Leucemia Asparaginase L-asparaginase Centrifugação Biofármacos Cromatografia
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: asparaginase | Biofármaco | ELP-intein | Purificação de proteina | Purificação de proteína

Resumo

A leucemia ocupou o primeiro lugar, entre as causas de morte por câncer em indivíduos menores de 18 anos. Como protocolo de tratamento para Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) utiliza-se, dentre outros quimioterápicos, a enzima L-Asparaginase (ASPase), a qual tem papel central, pois ao depletar o aminoácido asparagina, induz os linfoblastos leucêmicos a entrarem em processo apoptótico. Existem no total, três tipos de ASPases que são utilizadas de forma terapêutica, porém, o Brasil só utiliza para o tratamento a forma nativa de Escherichia coli (Elspar®). O Brasil não produz industrialmente nenhum biofármaco, sendo os processos de purificação uma das etapas mais caras na obtenção destes, pois via de regra envolvem cromatografia. Visto a relevância deste biofármaco, propomos construir um vetor que permite a super-expressão da enzima L-Asparaginase, e a posterior purificação sem etapas cromatográficas. O método consiste na adição à proteína de interesse de uma cauda com dois domínios de propriedades particulares, denominada "ELP-intein". O primeiro domínio (elastin like polypeptide - ELP) precipita reversivelmente com o aumento mediano da temperatura, permitindo a separação do complexo em fusão ELP-intein-asparaginase do meio fermentado ou de lisado celular, através de centrifugação. O segundo domínio (intein) realiza a auto-clivagem espontânea sob mudanças de pH da solução, liberando a cauda ELP-intein da asparaginase. Assim, ao elevar a temperatura e centrifugar novamente, a asparaginase estará livre e sem fusão no sobrenadante. Este projeto apresenta como proposta a construção de uma proteína de fusão que permitirá o uso de uma técnica viável e econômica para a produção da asparaginase recombinante em escala industrial no Brasil.