Edição de genoma via CRISPR/Cas9 a fim de modificar a biossíntese de lignina em Nicotiana tabacum

• Processo: 16/15834-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de outubro de 2016
• Data de Término da vigência: 14 de março de 2017
• Área de conhecimento: Ciências Agrárias - Agronomia
• Pesquisador responsável: Paulo Mazzafera
• Beneficiário: Nathalia Volpi e Silva
• Supervisor: Nicola Joan Patron
• Instituição Sede: Instituto de Biologia (IB). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: Earlham Institute (EI), Inglaterra
• Vinculado à bolsa: 14/17831-5 - Ácido clorogênico e sua relação com a biossíntese da lignina, BP.DR
• Assunto(s): Genética vegetal Melhoramento genético vegetal Fisiologia molecular CRISPR-Cas9
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cas9 | CCoAOMT | chlorogenic acid | Crispr | genome editing | Hct | lignin | Genética e fisiologia molecular de plantas

Resumo

A edição de genoma mediada pela tecnologia de clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 system (CRISPR/Cas9) tem se mostrado uma ferramenta poderosa e promete revolucionar o uso da biotecnologia no melhoramento genético de plantas. Adaptado do sistema de defesa de procariontes, a edição de genoma utilizando CRISPR/Cas9 possibilita o estudo de regulação gênica de plantas de maneira mais acurada, considerando que esta técnica tem alta reprodutibilidade. O desenvolvimento desse sistema de edição de genoma abre um novo horizonte na genética de plantas. Isto se deve ao fato dessa tecnologia permitir o desenvolvimento de homozigotos bi-alélicos na geração T0, além disso, existe a possibilidade de gerar plantas que contenham a mutação de desejada de forma "livre de transgênicos". Neste projeto, propomos fazer a edição genoma do tabaco (N. tabacum), utilizando tecnologia CRISPR/Cas9, a fim de entender o fluxo de carbono no metabolismo de lignina através de ácido clorogênico (CGA). Dois genes, HCT e CCoAOMT serão utilizados para mutagênese. Além de celulose, a lignina representa o principal composto da parede celular de plantas. A lignina, é um grande desafio no processamento de biomassa, como na produção de bioetanol de segunda geração. Em contrapartida, o acúmulo de CGA desperta grande interesse econômico. Esses compostos fenólicos são parte de um grupo de antioxidantes de grande importância tanto na resposta de defesa em plantas e como na dieta humana. As vias de biossíntese de CGA e de lignina estão interligados pelo cafeoil CoA assim, é possível que CGA atue como um doador esqueleto de carbono no metabolismo de lignina. No trabalho vinculado a este projeto (FAPESP 2014 / 1781-5), desenvolvemos mutantes duplos e individuais para HCT, HQT e CSE usando métodos de transformação tradicionais para provar esta hipótese. Desenvolver mutantes para CCoAOMT e HCT iria completar o nosso trabalho, considerando que foram feitas apenas transformações transientes para HCT em tabaco e que a ligação de CCoAOMT com CGA ainda não foi completamente esclarecida. Acreditamos que podemos superar o nanismo descrito anteriormente em plantas silenciadas de HCT acrescentando paclobutrazol (PAC) para bloquear o acumulo de SA. Propomos também explorar a flexibilidade da via lignina acrescentando cafeato como substrato durante o desenvolvimento da planta. Teoricamente, a adição de cafeato pode levar à produção de ácido ferrúlico pela COMT e, subsequentemente, para feruoil CoA por 4CL, que pode então ser utilizado para a produção de lignina. Como resultado, a via de lignina poderia produzir a subunidade S e G da lignina enquanto a via de CGA via poderia produzir CGA através HQT. Desta forma, esperamos obter mais informações para confirmar CGA e ligação lignina. (AU)