Validação funcional de poteciais non-coding RNAs diferenciamente expressos durante o ciclo de vida de Leishmania viannia braziliensis

• Processo: 20/00087-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de outubro de 2020
• Data de Término da vigência: 01 de outubro de 2024
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
• Pesquisador responsável: Angela Kaysel Cruz
• Beneficiário: Caroline Ricce Espada
• Instituição Sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 18/14398-0 - Centro Reino-Unido-Brasil para o Estudo da Leishmaniose (JCPiL), AP.TEM
• Bolsa(s) vinculada(s): 22/10270-4 - Investigação de interações RNA não-codificante-proteína em Leishmania (Viannia) braziliensis: identificando ligantes e avaliando os perfis de interação., BE.EP.PD
• Assunto(s): Biologia molecular Leishmania Expressão gênica RNAs não codificadores CRISPR-Cas9 Inativação gênica
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cas13 | Cas9 | Crispr | gene expression | Leishmania Viannia braziliensis | non-coding RNAs | Biologia Molecular de Leishmania

Resumo

Durante seu ciclo de vida, o parasita digenético Leishmania coloniza ambientes hostis, com diferentes características fisiológicas, exigindo precisão na modulação da expressão de genes. Sua organização genética com características peculiares, como a falta de promotores canônicos para a RNA polimerase II, a transcrição de genes não relacionados em unidades policistrônicas e o processamento do mRNA maduro por trans-splicing sugere que a regulação da expressão gênica nestes organismos resulta principalmente de modificações pós-transcricionais. Sabe-se que RNAs não codificadores de proteínas (ncRNAs) podem desempenhar um papel fundamental na regulação da expressão gênica em eucariotos. Esses elementos foram identificados no genoma de tripanosomatídeos nos últimos anos e com o avanço das abordagens de bioinformática, novos ncRNAs putativos vêm sendo descritos nestes organismos. O papel funcional desses elementos na regulação da expressão gênica nesses parasitas, no entanto, ainda não foi acessado com propriedade. O laboratório da Dra. Cruz tem buscado entender como se dá a regulação da expressão gênica de Leishmania, com o objetivo em longo prazo de encontrar alvos potenciais para o desenvolvimento de novos medicamentos ou vacinas. Recentemente, 295 ncRNAs foram encontrados pelo grupo como diferencialmente expressos entre os diferentes estágios de vida de L. (V.) braziliensis. Neste projeto, estamos propondo investigar o papel funcional destes ncRNAs. Isto será feito a partir de uma varredura inicial de aproximadamente 50 ncRNAs, os quais serão deletados dos parasitas utilizando a técnica de edição gênica por CRISPR/Cas9. Cada linhagem nocaute gerada carregará uma sequência específica de nucleotídeos (barcode) e serão então submetidas à caracterização fenotípica de crescimento, sobrevivência após jejum e infectividade, a fim de desvendar o papel funcional desses ncRNAs diferencialmente expressos no fitness do parasita. Uma vez que o nocaute de elementos que emergem de regiões não traduzidas (UTRs) pode levar a alterações fenotípicas que resultem de modificação da estabilidade do mRNA ou da taxa de tradução, e não necessariamente causados pelo ncRNA, também estamos propondo desenvolver um sistema de silenciamento de RNA utilizando o sistema CRISPR/Cas13 para tripanosomatídeos. Isso seria uma ferramenta valiosa para caracterizar o papel funcional de ncRNAs emergentes de UTRs, por atuar no nível de RNA, deixando o genoma do parasita inalterado. Nossos resultados ajudarão a entender a regulação da expressão gênica de Leishmania e podem resultar na descoberta de ncRNAs e vias essenciais do parasito, que podem ser direcionados no futuro para descoberta de novos medicamentos ou vacinas. (AU)