Uso de biossensor geneticamente codificado (PxIII-roGFP) para o monitoramento da produção de hidroperóxidos orgânicos e o papel destes na sinalização celular

• Processo: 21/00349-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de fevereiro de 2022
• Data de Término da vigência: 01 de fevereiro de 2026
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Flavia Carla Meotti
• Beneficiário: Mikaela Peglow Pinz
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 18/14898-2 - Processos redox na inflamação e o seu papel sobre doenças inflamatórias, AP.JP2
• Bolsa(s) vinculada(s): 23/14552-7 - Uso de um novo biossensor (PxIII-roGFP2) para estudar a sinalização redox em células de mamíferos em um cenário de aterosclerose., BE.EP.PD
• Assunto(s): Aterosclerose Inflamação Sinalização redox
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: aterosclerose | Hidroperóxidos orgânicos | Inflamação | PxIII-roGFP2 | Sinalização Redox | inflamação processos redox

Resumo

A inflamação é uma resposta fisiológica a diversos tipos de lesões, com a finalidade de reparar o tecido danificado e restaurar a homeostase. Entretanto, a perpetuação da inflamação pode estar associada a um aumento de espécies oxidantes e um desequilíbrio redox. Os hidroperóxidos orgânicos formados em processos oxidativos atuam como moléculas de sinalização que estimulam a expressão gênica e a sobrevivência celular, mas também podem atuar como mediadores citotóxicos. O desenvolvimento de biossensores baseados em proteínas fluorescentes como a GFP (green fluorescent protein) permitem o monitoramento de forma não invasiva e em tempo real da produção de oxidantes célular. Além disso, podem ser geneticamente direcionadas para diferentes compartimentos celulares e promover estudos dinâmicos de uma maneira sensível e específica. As variantes sensíveis redox de GFP (roGFP) apresentam meios ainda mais aprimorados e podem ser acopladas a enzimas sensíveis a certos oxidantes, para um monitoramento mais específico dos mesmos. Até o momento não existem biossensores capazes de detectar hidroperóxidos orgânicos. Sendo estes hidroperóxidos importantes mediadores da resposta inflamatória, o primeiro objetivo do presente projeto é realizar a expressão de um novo biossensor roGFP2 fusionado à glutationa-like peroxidase de Trypanosoma brucei (PxIII-roGFP2) em Escherichia coli (E. coli) seguido da purificação e caracterização da cinética de reação com hidroperóxidos orgânicos de relevância biológica. O segundo objetivo é transfectar essa sonda em diferentes linhagens célulares: células embrionárias de rim humano (HEK293T), células leucêmicas promielocíticas humanas (HL-60), células leucêmicas monocíticas humanas (THP-1) e em Bone Marrow-derived Macrophage (BMDM) de roedores para o monitoramento da produção de hidroperóxidos orgânicos sob diferentes estímulos. O terceiro objetivo é detectar os hidroperóxidos orgânicos em células HL-60, THP-1, BMDM e HEK293T por espectrometria de massas e comparar a eficiência do biossensor com a técnica utilizada atualmente. O quarto objetivo deste projeto é realizar uma análise dinâmica e espaço-temporal dos níveis de hidroperóxidos orgânicos. Para isso, o biossensor PxIII-roGFP2 será geneticamente direcionado para o citosol ou para a mitocôndria de células HL-60 e THP-1. O quinto objetivo deste estudo é avaliar como a expressão de genes envolvidos na sinalização redox e inflamatória pode ser afetada nas células HL-60,THP-1 e BMDM (expressando o biossensor PxIII-roGFP2) sob diferentes estímulos. O sexto objetivo é monitorar o estado redox de células HL-60, THP-1 e BMDM ativadas e correlacionar a expressão de marcadores do processo apoptótico com os níveis de hidroperóxidos orgânicos. De maneira geral, o presente projeto, busca uma melhor compreensão do papel desempenhado pelos oxidantes (mais especificamente os hidroperóxidos orgânicos) em vias de sinalização inflamatória. A utilização do biossensor PxIII-roGFP2 é uma ferramenta biológica muito inovadora e, a partir dos estudos de caracterização e aplicações do presente projeto, geraremos oportunidades sem precedentes para estudos adicionais e mais detalhados na biologia redox em diferentes processos.