Obtenção da GFP recombinante fusionada a uma sequência degron C-terminal para testes de interação com Hsp70s humanas

• Processo: 24/14681-4
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de novembro de 2024
• Data de Término da vigência: 31 de outubro de 2025
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular
• Pesquisador responsável: Julio Cesar Borges
• Beneficiário: Martina Jusan Fernandes Dau
• Instituição Sede: Instituto de Química de São Carlos (IQSC). Universidade de São Paulo (USP). São Carlos , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 17/26131-5 - Chaperoma: estudo da relação entre a estrutura dos seus componentes e a manutenção da proteostase, AP.TEM
• Assunto(s): Complexo de endopeptidases do proteassoma Proteínas
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: eGFPuv-dCL1 | HSPAs | Hsp70s citoplasmáticas | Proteassoma | Proteínas

Resumo

As chaperonas moleculares são proteínas responsáveis pelo controle de qualidade proteico, participando inclusive no processo de identificação de proteínas mal enoveladas e de encaminhamento para degradação. As proteínas de choque térmico humano 70 kDa (Hsp70 ou HSPA em humanos) compreendem uma família de chaperonas que também atuam no sistema proteassoma via ubiquitina por meio de um complexo mecanismo envolvendo as Hsp90 citoplasmáticas e cochaperonas, como a CHIP (C-terminus of Hsc70-interacting protein), uma E3 ubiquitina ligase. Para estudar esse sistema propões a utilização de uma variante instável da proteína verde fluorescente GFP com uma sequência degron CL1 no seu C-terminal (eGFPuv-dCL1). Em modelo celular expressando a eGFPuv-dCL1, demonstramos que a inibição das Hsp70 por meio do inibidor específico MKT-077 ocasiona o acúmulo da eGFPuv-dCL1 em células HEK293 avaliado pelo incremento da fluorescência verde nessas células. Esses resultados sugerem que o endereçamento da eGFPuv-dCL1 ao proteassoma está prejudicada. Entretanto utilizando o inibidor geldanamicina (GA) para as Hsp90 o acúmulo de eGFPuv-dCL1 não foi observado. Esses dados sugerem que as Hsp70s citoplasmáticas, e não as Hsp90s, estão envolvidas no encaminhamento da eGFPuv-dCL1 para degradação via proteassoma. Nesse contexto, o projeto de iniciação científica visa estudar a interdependência entre as Hsp70s e o sistema de degradação, por meio da interação física entre a eGFPuv-dCL1 e as Hsp70 citoplasmáticas humanas. Para isto, o objetivo desse projeto é produzir, purificar e caracterizar a eGFPuv-dCL1 recombinante para testes de interação com 2 das principais Hsp70 citoplasmáticas humanas recombinantes.