Alterações moleculares no gene da banda 3 (AEI) na esferocitose hereditaria e a participação da isoforma renal no equilibrio acido-basico

Autor(es)

Paulo Roberto Moura Lima

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2000-08-31

Membros da banca

Sara Teresinha Olalla Saad; Maria Sttela Figueiredo; Jose Butori Lopes de Faria; Jose Antonio Rocha Gontijo; Miriam Aperecida Boim

• Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad

Resumo

A esferocitose é um tipo comum de anemia hemolítica hereditária cujo primeiro defeito molecular foi caracterizado em 1992. A proteína banda 3, codificada pelo gene AE1, foi a primeira isoforma clonada de uma famma de genes de trocadores de ânions "Anion Exchanger-AE gene family" e é a mais abundante das proteínas integrais da membrana eritrocitária. Alterações moleculares neste polipeptídeo estão associadas à formação de esferócitos. Hemácias esferocíticas são osmoticamente frágeis, estando mais sujeitas à lise e ao sequestramento pelo baço, o que encurta seu tempo de vida. A proteína banda 3 também é expressa nos rins, na membrana basolateral de células alfa intercaladas do tubo coletor cortical, onde é responsável pela reabsorção de bicarbonato, compensando a secreção de ácidos pela H+ ATPase vacuolar apical, e participando da regulação fina do equilíbrio ácido-básico. Tanto a banda 3 eritrocitária como a renal são isoformas de um mesmo gene que através de um promotor tecido específico, diferem quanto à transcrição. O mRNA da banda 3 renal não apresenta os três primeiros exons observados na forma eritróide. O presente estudo teve o objetivo de investigar as alterações moleculares e regulação do gene da banda 3 na esferocitose hereditária em 5 pacientes com deficiência de banda 3, e investigar possíveis alterações neste gene em cinco pacientes com acidose renal tubular distal. Este estudo foi baseado no rastreamento de mutações e polimorfismos no gene mencionado, incluindo a região promotora, que também pode estar envolvida na fisiopatologia da doença. Para detecção das alterações moleculares foram utilizadas as técnicas de PCR, análise de polimorfismo de conformação em fita simples, subclonagem e sequenciamento. O estudo do cDNA foi realizado após a transcrição reversa do mRNA extraído de reticulócitos por RT-PCR. Outro objetivo foi investigar as alterações renais de pacientes com esferocitose hereditária e deficiência de banda 3, uma vez que esta proteína também é expressa nos rins. Os estudos renais foram realizados através da avaliação da capacidade de acidificação tubular distal e obtenção de medidas de bicarbonatúria, pH urinário, acidez titulável e excreção de amônia no período basal e após estímulo com furosemida. Também foi avaliado o contratransporte de sódio e lítio em hemácias de pacientes com esferocitose hereditária, uma vez que esta é uma medida indireta do contra-transporte Na+/H+, envolvido na regulação do pH intracelular do eritrócito e na homeostase ácido-básica do organismo, por secretar ácido e reabsorver Na+ em epitélio renal. Nossos resultados caracterizaram duas novas mutações no gene AEI. O estudo da Banda 3 Campinas, uma mutação no sítio doador de clivagem no intron 8, demonstrou a perda de bicarbonato pela urina dos pacientes afetados e um aumento na atividade de contra-transporte de sódio e lítio nas hemácias. A Banda 3 Pinhal, uma substituição de um resíduo de arginina altamente conservado, por histidina no domínio transmembrana, é a segunda mutação afetando o codon 490 da banda 3, e pode ser um "hot spot" para mutações no gene AEI. As hemácias destes pacientes apresentaram menor número de sítios para o inibidor DIDS. Outra mutação caracterizada foi a Banda 3 MODtefiore, previamente descrita. O estudo dos pacientes com acidose renal tubular distal revelou uma nova mutação na região promotora renal em um paciente com acidose renal tubular distal incompleta, que pode estar associada com o defeito na reabsorção de bicarbonato pelos rins. O estudo da acidose também caracterizou um novo polimorfismo no intron 3, a deleção da adenina 1233, com frequência alélica de 0,34 em 120 cromossomos analisados. Um conflito de sequência (quatro guaninas no lugar de três nt. 1272-1274) também foi verificado em todos indivíduos estudados. O polimorfismo Asp38-7Ala (Darmstad) foi encontrado em uma paciente com acidose, mas parece não estar relacionado com a doença. Finalmente concluímos que mutações no gene da banda 3 podem estar associadas com a esferocitose hereditária e com a acidose renal tubular distal incompleta, pois isoformas da proteína são expressas nas hemácias e nas células a-intercaladas. Sugerimos que em casos onde há perda de ânions pelos rins, mecanismos de compensação podem estar ativados, como o aumento da atividade excretora de prótons pela Na+/H+, ou pela H+-ATPase vacuolar apical. A fim de realizar estudos de interações protéicas, foi subclonado o domínio citoplasmático completo da fosfolípide scramblase dos seguintes tecidos humanos: cérebro, testículos e baço. A sequência do cDNA da enzima scramblase usada no ensaio duplo-híbrido resultou no fenômeno de auto-ativação, que é uma razão comum da falha do rastreamento pelo método duplo-híbrido (AU)

• Processo FAPESP: 97/00939-0 - Alterações moleculares no gene da banda 3 (ânion exchanger 1) na esferocitose hereditária e o envolvimento da isoforma renal no equilíbrio ácido-básico
• Beneficiário: Paulo Roberto Moura Lima
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado