Analise comparativa da expressão de genes de Xylella fastidiosa associados a patogenicidade e formação de biofilme

Autor(es)

Alessandra Alves de Souza

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2004-06-18

Membros da banca

Marcos Antonio Machado; Claudia Barros Monteiro Vitorello; Jose Camillo Novello; Marie Anne Van Sluys

• Orientador: Marcos Antonio Machado

Resumo

O presente trabalho tem como objetivo detectar e estudar a expressão de genes possivelmente envolvidos com patogenicidade da estirpe 9a5c de X. fastidiosa. Para desenvolvimento do trabalho foram utilizadas bactérias imediatamente após o isolamento da planta sintomática, denominado aqui isolamento primário (IP) e bactérias após 46 repicagens (SR) sucessivas em meio de cultura. Uma possível perda de virulência da X. fastidiosa submetida às condições de SR foi verificada inoculando-se plantas de laranja doce (Citrus sinensis) e vinca (Cataranthus roseus) com as bactérias obtidas nestas condições. Através do uso de PCR quantitativo em tempo real, foi verificado que a colonização das células originadas de SR foi menos eficiente em ambos hospedeiros. A tecnologia de DNA 'microarray' foi utilizada para investigar as mudanças da expressão gênica associadas com a condição IP. Verificou-se que muitos dos genes diferencialmente expressos codificam para proteínas hipotéticas. Genes potencialmente envolvidos com patogenicidade, virulência e adaptação foram induzidos apenas na condição IP. Três destes genes (fimA, hsf e uspA1) foram associados com adesão na superfície do hospedeiro e quatro (msrA, acrA, cvaC e xpsE) com a capacidade de adaptação do patógeno no ambiente do hospedeiro. A indução destes genes na condição IP foi confirmada por RT-PCR tanto na condição in vitro quanto na condição in planta 15 dias após inoculação, período este que corresponde ao início da colonização. Contudo, 90 dias após inoculação, período de colonização mais avançada com o surgimento dos primeiros sintomas, o nível de expressão dos genes de adesão foi similar em ambas condições de crescimento. Entretanto, uma maior expressão foi observada na condição IP para os genes envolvidos com adaptação no ambiente do hospedeiro. Estes resultados sugerem que a adesão é importante para o início da formação do biofilme. Por outro lado, os genes relacionados com adaptação são essenciais para manutenção do biofilme in planta. Também, a expressão destes genes durante a formação de biofilme in vitro em X. fastidiosa foi avaliada por RT-PCR semi-quantitativo após 3, 5, 10, 20 e 30 dias de crescimento em superfície de vidro na interface líquido-ar. A expressão dos genes na condição in vitro foi similar à condição in planta, onde os genes de adesão tiveram uma maior indução nas etapas inicias de formação de biofilme. Estes resultados indicam que estes genes podem estar envolvidos com a adesão em diferentes superfícies. Entretanto, apenas alguns genes relacionados à adaptação (xpsE, acrA) se comportaram de forma similar ao observado in planta, ou seja, com maior indução na etapa de biofilme maduro. Isto pode ser resultado dos diferentes ambientes experimentais utilizados, uma vez que, a expressão destes genes pode ser regulada de acordo com o ambiente pela qual a bactéria é exposta. Análises de microscopia ótica em diferentes fases do biofilme formado em lâminas de vidro revelaram que a formação de biofilme em X. fastidiosa apresenta pelo menos cinco fases distintas, sendo aos 20 dias a fase de maior densidade celular. Vários são os estudos que visam detectar os genes expressos em diferentes fases e ambientes da formação de biofilme, principalmente em bactérias que causam doenças em humanos, uma vez que, a formação do biofilme tem sido atribuída como a causa de sérias doenças. Contudo, há poucas informações em relação à expressão de genes envolvidos na formação de biofilme em patógenos de plantas. Por este motivo, e como a formação de biofilme indica ser o mecanismo primário de patogenicidade de X. fastidiosa, foi utilizada a tecnologia do DNA 'microarray' para avaliar os genes expressos na fase de biofilme maduro comparado ao crescimento planctônico. Um total de 202 genes (9,18%) foram significativamente induzidos, enquanto que 32 genes (1,45%) foram reprimidos na condição de biofilme. A maioria dos genes diferencialmente expressos codifica para proteínas ainda hipotéticas. Na condição de crescimento em biofilme foi verificado um aumento da expressão de genes 'housekeeping¿ que codificam funções metabólicas. Também foi detectado um grande número de genes do mega plasmídio pXF51 sendo diferencialmente expresso, o que poderia provavelmente estar associado com transferência horizontal de genes em X. fastidiosa em biofilme. Em relação a categoria de patogenicidade, a maioria dos genes expressos na condição de biofilme foram associados com produção e detoxificação de toxinas e adaptação para crescimento em condições atípicas. A expressão destes genes associados com adaptação pode conferir características competitivas à X. fastidiosa no habitat a ser colonizado, dando uma clara indicação da importância destes fatores no estabelecimento do biofilme. Tais afirmações demonstram que a propriedade fisiológica do biofilme de X. fastidiosa é similar ao observado em bactérias patogênicas em humanos, indicando que a formação de biofilme como mecanismo de patogenicidade de bactérias de diferentes hospedeiros apresentam características comuns (AU)

• Processo FAPESP: 00/13929-8 - Análise comparativa da expressão de genes de Xylella fastidiosa no processo de adesão
• Beneficiário: Alessandra Alves de Souza
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado