Avaliação in vitro dos efeitos do Heme livre sobre ativação da coagulação e sobre a quebra de barreira endotelial

Autor(es)

Gleice Regina de Souza

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências Médicas
• Data de defesa: 2014-09-19

Membros da banca

Erich Vinicius De Paula; Paula Ribeiro Villaça; Camila Almeida

• Orientador: Erich Vinicius De Paula

Resumo

Há cerca de 50 anos sabe-se que pacientes com anemia falciforme (AF) apresentam maiores concentrações plasmáticas de heme livre. Recentemente, foi demonstrado que o heme é capaz de ativar a resposta imune inata, desencadeando resposta dependente de receptores "Toll-like", envolvendo a expressão de vários genes pró-inflamatórios. Em consonância com estes achados, o papel pró-inflamatório do heme foi confirmado em diferentes modelos experimentais de AF, colocando este metabólito como potencial desencadeante da oclusão microvascular e síndrome torácica aguda. Tromboses micro e macro vasculares são características da AF, e o papel do heme na patogenia destes eventos foi recentemente sugerido pela demonstração de sua capacidade de induzir a expressão de fator tecidual (FT) em células endoteliais e monócitos. No entanto, a relevância funcional da expressão deste achado ainda não foi demonstrada através de marcadores clinicamente relevantes da coagulação. Métodos: A expressão do FT induzida pelo heme foi avaliada em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) através de dois ensaios globais da hemostasia: tromboelastometria (TEM) e teste de geração de trombina (TGT). Sangue de voluntários saudáveis foram coletados por uma veia antecubital com mínima estase em tubos de citrato de sódio (1:10) ou heparina. A TEM foi realizada em amostras de sangue total (n=10) incubadas com 30 ?M do heme (Sigma¿Aldrich) durante 4 horas a 37°C, em um equipamento ROTEM (Pentapharm). A coagulação foi ativada pela adição de CaCl2. Como controle, amostras dos mesmos indivíduos foram incubadas concomitantemente com o veículo (n=10). O TGT foi realizado em amostras de plasma duplamente centrifugadas, separadas a partir de sangue total estimulado com heme ou veículo sob as mesmas condições (n=16). A TGT foi realizada utilizando flurímetro Fluoroskan Ascent® (Thermolab). A coagulação foi ativada com FT (5pM) e fosfolipídios ( Reagente PPP, Thrombinoscope). A expressão de FT foi avaliada por qRT-PCR. PBMC e neutrófilos foram separados por centrifugação de gradiente de densidade (Ficoll) e então incubados com 30 uM de heme (n=6) ou salina (n=6) por 24hs. Teste estatístico não-paramétrico foi utilizado em todas as análises. Resultados: a incubação do sangue total com 30 uM de heme resultou numa potente indução de expressão de FT quando comparado com o veículo em PBMC (AU) (0,03±0,06 vs 1,18±0,60; P=0,03). Não foi possível detectar a expressão de FT em neutrófilos. A ativação da coagulação induzida pelo heme pode ser demonstrada através da TEM. O Heme diminuiu significativamente o tempo de coagulação (seg) (562,1±88,2 vs 387±84.3; P=0,002) e a MaxV-t (tempo para a velocidade máxima) (651,4±119,2 vs 451,1±87,4; P=0,002), que são dois indicadores de um estado de hipercoagulabilidade. Uma tendência para a diminuição do tempo de formação do coágulo também pode ser observada (P=0.07). Nenhuma diferença pode ser observada na área sob a curva da TEM. Um perfil de hipercoagulabilidade, também foi observado no TGT. Mudanças estatisticamente significativas, compatíveis com a ativação da coagulação foram observadas em parâmetros como: pico de trombina (aumentado), tempo para atingir a trombina (diminuição), índice de velocidade (aumento), período de latência (diminuição) e StarTail (diminuição) (todos<0,05). Nenhuma mudança estatisticamente significativa pode ser observada no parâmetro de pontencial endógeno de trombina. Discussão e Conclusão: A TEM e o TGT são dois testes globais em hemostasia, amplamente utilizados para avaliação de estados de hipo e hipercoagulabilidade. Ambos os métodos tem sido utilizados em pacientes com AF, que apresentam estado de hipercoagulabilidade similar ao encontrado em nosso trabalho, caracterizada por um início mais rápido da ativação da coagulação. Nossos resultados demonstram pela primeira vez que o heme, em concentrações semelhantes às observadas em pacientes com AF, é capaz de estimular não só a expressão do TF em PBMC, mas também de alterar o equilíbrio da coagulação para um estado de hipercoagulabilidade. Estes resultados fornecem um suporte adicional à hipótese de que o heme é um mediador chave na trombose micro e macro vascular na AF e, possivelmente, em outras doenças hemolíticas. Nosso estudo também avaliou de forma preliminar, o efeito do heme sobre a fosforilação do resíduo S879 da proteína p120-catenina, como um marcador indireto da quebra de barreira endotelial. Os resultados, ainda preliminares, sugerem que pode haver um efeito do heme sobre a integridade de barreira endotelial, fato que será investigado em estudos futuros

• Processo FAPESP: 12/10859-6 - Avaliação de alterações funcionais nas junções do tipo adherens induzidas pelo choque séptico em culturas de células endoteliais
• Beneficiário: Gleice Regina de Souza
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado