Caracterização celular e molecular das proteínas gigantes do citoesqueleto de Trypanosoma brucei

Autor(es)

Bernardo Pereira Moreira

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Ribeirão Preto.
• Instituição: Universidade de São Paulo (USP). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (PCARP/BC)
• Data de defesa: 2016-12-16

Membros da banca

Munira Muhammad Abdel Baqui; Angela Kaysel Cruz; Juliana Lopes Rangel Fietto; Sergio Schenkman; Luiz Ricardo Orsini Tosi

• Orientador: Munira Muhammad Abdel Baqui

Resumo

O Trypanosoma brucei é o agente etiológico da Tripanossomíase Africana Humana. Este protozoário é um parasita extracelular que possui um único flagelo e um citoesqueleto de alta estabilidade, responsável por vários processos celulares como motilidade, morfologia, infectividade e divisão celular. Em todos os gêneros da família Trypanosomatidae foram descritas proteínas de alto peso molecular (500-3500 kDa) as quais, além do papel estrutural, podem estar envolvidas na organização e regulação do citoesqueleto e seus constituintes. Este projeto teve como objetivo caracterizar no âmbito celular, bioquímico e molecular as proteínas gigantes de T. brucei e determinar os seus papéis funcionais na biologia do parasito. A partir do isolamento do citoesqueleto de T. brucei e análise por SDS-PAGE, produzimos anticorpos contra as proteínas gigantes que serviu como ferramenta para realização de Western Blotting (WB) e imunofluorescência no estudo das propriedades moleculares destas proteínas. O sequenciamento por espectrometria de massas foi utilizado para determinação da sequência primária parcial destas proteínas e identificação dos genes em no banco de dados TriTrypDB. Aqui, mostramos que as proteínas de alta massa molecular se localizam em estruturas essenciais para a regulação do citoesqueleto como na zona de adesão flagelar (FAZ), bem como no complexo tripartido responsável pela adesão do flagelo ao cinetoplasto. A espectrometria de massas revelou 19 novas proteínas de alta massa molecular ainda não estudadas em T. brucei dentre as quais 2 foram caracterizadas funcionalmente: FAZ10 e Tb927.8.3540. Para investigar os seus papeis biológicos utilizamos o modelo de silenciamento gênico por RNA de interferência. O silenciamento da proteína FAZ10 levou ao destacamento do flagelo, ao reposicionamento incorreto dos núcleos e cinetoplastos, e mais importante ao erro na definição do local de ingressão do sulco de clivagem durante a citocinese, em formas procíclicas e sanguícolas de T. brucei. Por sua vez, a proteína Tb927.8.3540 é responsável pela estabilização do citoesqueleto de microtúbulos e formação do FAZ e flagelo. Quando ausente nas células, estas adquirem um formato esférico com a presença de um flagelo internalizado. Em ambos os casos, as células induzidas apresentam inibição da proliferação celular e o acúmulo de células multinucleadas na cultura. O estudo funcional das proteínas gigantes revelou que elas possuem um papel central na morfogênese do T. brucei, agindo diretamente na organização e formação de estruturas do citoesqueleto, na manutenção da adesão flagelar, e no direcionamento da citocinese. (AU)

• Processo FAPESP: 12/22129-2 - Caracterização funcional da proteína gigante de Trypanosoma brucei
• Beneficiário: Bernardo Pereira Moreira
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado