Expressão heteróloga de uma protease coagulante produzida por Thermomucor indicae-seudaticae N31 em Escherichia coli e Pichia pastoris

Autor(es)

Waldir Eduardo Simioni Pereira

• Tipo de documento: Dissertação de Mestrado
• Imprenta: São José do Rio Preto. 2019-05-21.
• Instituição: Universidade Estadual Paulista (Unesp). Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas. São José do Rio Preto
• Data de defesa: 2019-04-26
• Orientador: Roberto da Silva; Mario Tyago Murakami

Resumo

Proteases são enzimas cuja função é a hidrólise de proteínas e peptídeos, gerando produtos de variados tamanhos. São produzidas pelos mais diversos organismos vivos e possuem um amplo espectro de aplicações. O objetivo desse trabalho foi promover a expressão heteróloga de uma protease coagulante produzida por Thermomucor indicae-seudaticae em Escherichia coli e Pichia pastoris, através da identificação do gene codificador da enzima. Para isso, foi realizada a comparação entre o genoma de T. indicae-seudaticae e Rhizomucor pusillus utilizado como referência. Os vetores pET 28ª (+) e pPICZαA foram sintetizados contendo o gene de interesse para a transformação em E. coli e P. pastoris respectivamente. Células competentes de cinco diferentes linhagens de E. coli foram transformadas e submetidas a teste de expressão em 20 °C e 37 °C por 24 horas, analisadas tanto a fração solúvel, quanto insolúvel, onde apresentaram, aparentemente, a expressão com maior quantidade em fração insolúvel. Células de P. pastoris foram transformadas e submetidas a expressão por 72 horas. O extrato enzimático bruto do produto gerado da expressão foi caracterizado bioquimicamente. A enzima recombinante produzida por E. coli apresentou máxima atividade de 250,89 U mL-1 utilizando caseína como substrato nas condições de pH 5,0 e temperatura de 50 °C, porém com estabilidade após 24 horas apenas nos pH 6,0 e 6,5, demonstrando assim ser sensível em pH alcalino. Enquanto que a enzima recombinante produzida por P. pastoris apresentou máxima atividade de 57,82 U mL-1 nas condições de pH 5,0 e temperatura de 60 °C. Ainda a enzima produzida por P. pastoris apresentou melhor termoestabilidade quando comparada com a produzida por E. coli e ambas as enzimas tiveram forte inibição da atividade por pepstatina A, confirmando pertencer a classe das proteases aspárticas e também pelo íon mercúrio o que confirma a presença de pontes dissulfeto na estrutura da enzima. (AU)

• Processo FAPESP: 17/14629-9 - Expressão heteróloga de uma protease coagulante produzida por Thrmomucor indicae-seudaticae N-31 em Escherichia coli e em Pichia Pastoris
• Beneficiário: Waldir Eduardo Simioni Pereira
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado