Estudo do mecanismo de ação da via da mTOR sobre a atividade da enzima glutaminase C e identificação e caracterização de modificações pós-traducionais nesta enzima

Autor(es)

Carolline Fernanda Rodrigues Ascenção

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2018-02-20

Membros da banca

Sandra Martha Gomes Dias; Jörg Kobarg; Talita Miguel Marin; Ana Karina de Oliveira; Juliana Helena Costa Smetana

• Orientador: Sandra Martha Gomes Dias

Resumo

Glutaminases (GLS) são enzimas envolvidas no crescimento e progressão tumoral dado seu papel na manutenção da homeostase redox, produção de energia e aumento de biomassa celular. Assim, as GLS têm sido caracterizadas como importantes para os processos de migração e invasão. A via da PI3K/mTOR está intimamente relacionada ao aumento de biomassa e crescimento tumoral, estando com sua função desregulada em tumores. mTOR regula glutaminases em nível de estabilidade de RNA em mecanismo envolvendo aumento traducional de c-MYC que, por sua vez, inibe a expressão de um miRNA, impactando nos níveis proteicos de GLS. Neste trabalho, interferimos na via da mTOR através da sua inibição com rapamicina ou pelo knockdown do regulador negativo TSC2, assim como a estimulamos pela expressão da RagB selvagem ou de um mutante constitutivamente ativo. Em todos os casos, observamos uma relação positiva entre a atividade de mTOR e a atividade de GLS, o que, entretanto, não envolveu alteração no nível proteico da enzima. Intrigados sobre qual poderia ser o mecanismo por trás da regulação, investigamos via espectrometria de massas se a glutaminase C (GAC, uma das isoforma do gene GLS) sofria modificações pós-traducionais ou ligação a parceiros de interação, dependentes da ação de mTOR. Como possíveis candidatos, identificamos a proteína Sec13 (componente de GATOR2), HNRNP H1 (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1), EEFD (Eukaryotic elongation factor delta) e ASS1 (Argininosuccinate synthase). Por outro lado, também identificamos uma fosforilação em serina 95 (S95) e acetilação na lisina 197 (K197), os quais, entretanto, não responderam diferencialmente ao tratamento com rapamicina. Verificamos que a expressão do fosfomimético S95D levou a diminuição na atividade de glutaminase de lisado celular. Em acordo, a expressão de GAC.S95D levou a diminuição nos fenótipos de proliferação e migração celular. Curiosamente, o mutante S95A, com pouco impacto na atividade de glutaminase, levou a um aumento proeminente de proliferação, migração e dos níveis de marcadores de transição epitélio-mesênquima (EMT). Tomados em conjunto nossos resultados apontam que GAC tem o potencial de ser regulada por mTOR via interação proteica. Além disto, mostramos que o N-terminal de GAC sofre fosforilação no resíduo S95 e, através do uso de mutantes, identificamos que esta modificação tem o potencial de afetar a função da enzima glutaminase endógena e parâmetros celulares tais como proliferação e migração (AU)

• Processo FAPESP: 13/23510-4 - Estudo do mescanismo de ação das vias de sinalização celular PI3K/AKt/mTOR e AMPK sobre a atividade da enzima glutaminase
• Beneficiário: Carolline Fernanda Rodrigues Ascenção
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado